[发明专利]携带miRNA抑制物的外泌体及其在制备治疗骨关节炎药物方面的应用

权利要求书

1.一种外泌体的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：

S1,收集干细胞的外泌体，外泌体的直径在30-150nm，依次包括：

使用无外泌体的细胞培养基培养干细胞，收集干细胞培养液的上清；

将收集的上清在0-5℃经过500g-10000g离心速度逐级增加的预离心；

取上清，使用PBS重悬并且1.0*10⁵-1.5*10⁵g离心60-100min，重复该步骤1-2次；

取上清，即得源自干细胞的外泌体；

S2，将miRNA-155-5p抑制物加入干细胞的外泌体内部，并被外泌体膜包裹；所述miR-155-5p抑制剂包括抑制miR-155-5p表达量或者表达活性的物质；

S3，收集已经包裹miRNA-155-5p抑制物的外泌体。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的预离心，是指将收集的上清依次经过4℃500g离心10min,2000g离心30min,10000g离心70min；或者所述的将miRNA-155-5p抑制物加入干细胞的外泌体内部使用脂质体转染或者电穿孔方法。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的收集干细胞的外泌体，包括：

无外泌体的细胞培养基中的血清是通过将胎牛血清使用120000g离心16小时后，取上清获得；或者

所述miR-155-5p抑制剂包括含有miR-155-5p的反义互补序列的小分子，或者在miR-155-5p基础上进行胆固醇修饰和2'OMe修饰。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1预离心后，取上清使用PBS洗涤1-2次，每次使用1.0*10⁵-1.5*10⁵g离心60-100分钟；或者步骤S2中，将20μg EVs和300pmolmiRNA-155-5p mimics加入到400μl电穿孔缓冲液中，置于4mm电击杯，电击参数250V、150μF、无穷大欧姆，电击次数固定10次。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，以人体脂肪干细胞提取的外泌体为基础制备包裹miRNA-155-5p抑制物的外泌体；

所述的制备方法包括以下步骤：

a.人脂肪干细胞的分离与鉴定：

利用人体脂肪提取人脂肪干细胞PBS清洗脂肪组织3遍，剪碎后利用0.1％胶原酶I消化60min，1200rpm离心5min，细胞培养于含10％FBS的F12/DMEM培养基，37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养24h后换液，细胞生长至80％融合时，0.25％胰酶消化后按1:3传代培养。消化细胞制成7管500μL单细胞悬液，分别加入2μL抗人CD44-FITC、CD90-FITC、CD73-FITC、CD19-FITC、CD34-FITC、CD45-FITC、CD105-PE单抗，37℃孵育30min，PBS清洗3遍；

b.人脂肪干细胞来源外泌体的分离：

(1)超速离心法制备无外泌体的胎牛血清：

将胎牛血清分装进入超速离心管，密封后称重配平至小数点后两位，采用超速离心机4℃，120000g离心16h，后用无菌巴氏吸管小心吸取管中上部2/3的血清，并用0.22um滤器过滤血清备用；

(2)人脂肪干细胞来源外泌体的富集：

野生型外泌体的富集：DMEM F12+10％FBS+10ng/ml bFGF的完全培养基培养1-6代，至人脂肪干细胞生长至80％后，换用无外泌体血清配制的培养基继续培养24h，收集细胞培养上清，用PBS清洗细胞表面粘附外泌体一并收集；

(3)外泌体的提取：

将收集的上清先依次经过4℃500g离心10min,2000g离心30min,10000g离心70min的预离心，在将上清小心转移至灭菌处理后的超速离心管中，密封后称重配平至小数点后两位，采用超速离心机4℃，100000g离心70min，用无菌巴氏吸管小心吸除上清并用1-2ml冷PBS重悬后，再次100000g离心70min，最后吸除PBS并每管用100μL无菌PBS重悬，并-80℃保存。