[发明专利]构建PARK7基因突变的帕金森病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用

说明书

本发明公开了涉及构建PARK7基因突变的帕金森病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。本发明提供了SEQ ID NO：16所示PARK7‑gRNA2、SEQ ID NO：17所示PARK7‑gRNA4和NCN蛋白在制备试剂盒中的应用。本发明还提供了制备重组猪细胞的方法：将PARK7‑gRNA2、PARK7‑gRNA4和NCN蛋白共转染猪细胞，得到重组猪细胞。所述重组猪细胞为PARK7基因发生突变的重组猪细胞。试剂盒的用途为：制备重组猪细胞；制备帕金森病模型猪；制备帕金森病细胞模型或帕金森病组织模型或帕金森病器官模型。本发明对于帕金森病药物的研发及揭示该病的发病机制具有重大应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体属于基因编辑技术领域，更具体涉及构建PARK7基因突变的帕金森病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。

背景技术

帕金森病(parkinson’s disease,PD)又称震颤麻痹，是一种中枢神经系统的慢性神经退化疾病，主要影响运动神经系统，其带来的主要运动症状合称为帕金森综合症。据估计，全球约有700-1000万人患有帕金森综合症，且该病的症状会随着年龄的增长缓慢出现，且男性较女性更容易发病。在60岁以上的老人中，其发病率高达1％；在80岁以上的老人中，其发病率更是高达1.9％。

PARK7基因(编码DJ1蛋白)的突变能够导致人类单基因常染色体隐性遗传性帕金森病。 DJ1蛋白具有多种保护多巴胺能神经元免受帕金森氏病神经退行性病变的特定机制。DJ1可作为氧化应激敏感的分子伴侣保护细胞抵抗由氧化应激引起的损伤作用,尤其是对线粒体的损伤。DJ1可增加两种线粒体解偶联蛋白(UCP4和UCP5)的表达，二者可使氧化磷酸化与呼吸链解偶联,通过维持线粒体膜电位、调节细胞内Ca²⁺稳态、减少氧自由基(ROS)生成、影响ATP 含量、调节神经元能量等机制起到神经保护作用。突变的DJ1蛋白会导致线粒体复合物I活性和线粒体膜电位均降低、线粒体断裂以及线粒体自噬等状况的出现，进而损伤神经元，引发帕金森病。

研究帕金森病的发生发展机制及研发相应的药物均需要在动物模型的基础上进行，目前常用的动物模型为小鼠模型，然而小鼠不论从体型、器官大小、生理、病理等方面都与人相差巨大，不能真实地模拟人类正常的生理、病理状态。猪作为大动物，其体型大小和生理功能与人类近似，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，是理想的人类疾病模型动物。

基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因编辑到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等编辑技术，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。

发明内容

本发明的目的是提供构建PARK7基因突变的帕金森病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。

本发明提供了PARK7-gRNA2、PARK7-gRNA4和NCN蛋白在制备试剂盒中的应用。

本发明还提供了PARK7-gRNA2、PARK7-gRNA4和PRONCN蛋白在制备试剂盒中的应用。

本发明还提供了PARK7-gRNA2、PARK7-gRNA4和特异质粒在制备试剂盒中的应用。

本发明提供了一种试剂盒，包括PARK7-gRNA2、PARK7-gRNA4和NCN蛋白。

本发明还提供了一种试剂盒，包括PARK7-gRNA2、PARK7-gRNA4和PRONCN蛋白。

本发明还提供了一种试剂盒，包括PARK7-gRNA2、PARK7-gRNA4和特异质粒。

以上任一所述试剂盒还包括猪细胞。