[发明专利]一种高对比度真菌荧光染色液及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种高对比度真菌荧光染色液的制备与应用。所述真菌荧光染色液分为A、B液，其中A液包括：荧光素、防淬灭剂、保湿剂、软化剂、通透剂和促溶剂等；B液包括：背景荧光染料和防腐剂等。本发明真菌荧光染色液能与真菌细胞壁有效结合，将真菌染成明亮蓝色，将样本背景染成暗红色，显著增大蓝色真菌与红色背景的对比度。同时，本荧光染色液能够大大提高真菌的判读效率以及准确率，降低检测人员操作难度，且区分A、B液储存有利于染色液长期保持优良染色效果。

技术领域

本发明属于微生物荧光染色技术领域，具体涉及一种高对比度真菌荧光染色液及其制备方法与应用。

背景技术

近年来，随着抗生素、免疫抑制剂等药物的广泛应用，由真菌引起的感染日益普遍。白念珠菌是最常见的条件致病性共生真菌之一，是健康人体微生物群的一部分，存在于宿主的口腔、表皮、胃肠道及阴道等处。对于免疫低下患者而言，念珠菌感染后病情发展快，在国内综合医院感染病死率达37.7％。并且与其他微生物感染相比，白色念珠菌拥有细胞壁结构，无特异性临床表现，极易导致漏诊误诊，耽误疾病的治疗。因此对白念珠菌感染的早期准确鉴定对于临床给药治疗以及流行病学研究有着重要意义。

传统的真菌诊断方法主要包括苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining)法、六胺银染色(GMS)法、碘酸雪夫氏染色(PAS)法、KOH湿片镜检法、真菌分离培养法以及荧光染色(CFW)法。一般染色法步骤较多，操作复杂，对检测人员要求较高，阳性检出率低；KOH湿片镜检法特异度和灵敏度均较低，背景干扰强，对检测人员技术水平要求较高，易存在漏诊错诊的问题；真菌分离培养法特异度高，能分辨菌属，但取材要求高检测周期长，存在假阳性。

荧光染色法是一种较为常见的真菌快速检测方法，大部分已投入使用的荧光染色液主要成分为荧光素、促溶剂和降背景染料等。荧光素能与真菌细胞壁特异性结合，在一定波长光的激发下结合了荧光素的真菌能够产生蓝色荧光，使得真菌被快速检出。此方法特异性较高，对操作人员技术水平要求低，周期短，阳性检出率高且不容易错检，因此成为了最常用的真菌检测方法之一。

现已投入市场应用的真菌荧光染色液大部分采用荧光增白剂作为荧光素，真菌能够在紫外光的激发下产生明亮蓝色荧光。然而，大部分荧光染色液采用伊文思蓝、溴酚蓝等能够吸收部分背景荧光的降背景试剂。但用采用该原理的染色液染色后，送检的人体皮屑、甲屑组织仍呈现蓝色，真菌呈现明亮蓝色，背景干扰强，较难区分。也有如专利CN111019999A公开的一种微生物荧光染色液，使真菌呈蓝色、绿色或红色，虽能有效检出真菌，但存在与背景对比度低的不足，容易造成漏检。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种高对比度真菌荧光染色液的制备与应用。本发明的目的是通过加入背景荧光染料，将皮屑、甲屑样本上皮细胞等组织染成暗红色，而真菌仍呈显明亮蓝色。增强蓝色真菌与红色背景的对比度，有利于检测人员快速判别真菌。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:

一种高对比度真菌荧光染色液，所述真菌荧光染色液由A液和B液组成，其中，所述A液包括终浓度为50-500mg/L(优选100-200mg/L，特别优选100-150mg/L)的荧光素，溶剂为水，所述的荧光素为荧光增白剂28、荧光增白剂367、荧光增白剂220、荧光增白剂85中的一种或两种以上的混合物；所述B液包括终浓度为1-100mg/L(优选70-100mg/L)的背景荧光染料，溶剂为水，所述背景荧光染料为中性红、罗丹明B、赤藓红、Cy5、藏花红T、DiI(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)、DiD(1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine,4-ChlorobenzenesulfonateSalt)中的一种或两种以上的混合物。