[发明专利]高比活碱性木聚糖酶突变体

说明书

本发明涉及基因工程与蛋白质改造技术领域，具体涉及一种高比活碱性木聚糖酶突变体及其应用。本发明以野生型木聚糖酶H1为基础，提供了分别包含I37L、G40E、V65E、F93W、D104F、N167T、I174L、F181Q单点突变以及T34C/T189C、V65S/I174V两点突变的突变体。与野生型木聚糖酶H1相比，本发明提供的木聚糖酶突变体的比活力普遍提高了9.5%‑64.1%；其中，含V65S/I174V两点突变的碱性木聚糖酶突变体的比活力最高，达2039.33 U/mg，有利于降低该酶的生产成本，促进其在工业领域的广泛应用。

技术领域

本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术领域，具体涉及一种高比活碱性木聚糖酶突变体及其应用。

背景技术

木聚糖是自然界中广泛存在的一种五碳糖，木聚糖酶是一类能将木聚糖降解为木二糖、木二糖以上的寡聚木糖及少量木糖等的酶，是在木聚糖降解过程中起关键作用的酶。由于木聚糖的组成成分复杂，其水解需要多种酶协同作用，所以广义上的木聚糖酶是指能够将木聚糖水解成寡糖或单糖的一系列酶的总称，包括内切β-1，4-D-木聚糖酶、β-D-木糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-D-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶、酚酸酯酶等，狭义上的木聚糖酶指内切β-1,4-D-木聚糖酶。木聚糖酶来源非常广泛，可以由不同种类的微生物产生。根据木聚糖酶对酸碱环境的耐受度，可以将其分为碱性、中性和酸性。

碱性木聚糖酶在造纸工业、饲料行业及食品工业中都起着十分重要的作用，尤其在造纸的制浆、促进漂白及废纸脱墨等的工业生产中，碱性木聚糖酶能显著降低造纸过程中的污染排放，提高产品的质量。目前木聚糖酶的商业化生产已经较为成熟，已经分离了多种产木聚糖酶的微生物，克隆并鉴定了编码木聚糖酶的基因。

蛋白质工程的概念提出以来，对于酶分子的改造经历了定向进化筛选、半理性设计和理性设计三个阶段。定向进化筛选是在不了解有关酶的结构与功能之间的关系等信息的情况下，通过对酶基因的随机突变和基因片段的重组来创造突变库，然后通过高通量的筛选手段鉴定性能改善的突变体，挑出有益突变基因作为下一轮突变的模板，进行多轮突变和筛选，以进一步提高酶的性能。半理性设计是利用计算机软件确定酶分子不稳定区域，对不稳定区域进行单点饱和突变、迭代突变等非理性设计，从而使酶的性质有所提升。理性设计是利用计算机分析软件和模拟软件等辅助手段来确定酶基因序列的不稳定区域，再对不稳定区域进行同源模板替换从而完成改造。

例如，Lai等从嗜碱芽孢杆菌（Bacillus sp．）中分离出一种新的耐高温和耐碱的木聚糖酶 xyn30Y5 基因，设计了47种突变体，其中21个突变体活性有所提高，再通过组合诱变，使得最佳突变体催化效率( k_cat/K_m) 和RA60_1/2h值增加了一倍，同时最适pH由7.0 提高至8.0，这不仅提供了一种具有工业应用潜力的新型耐高温和耐碱的木聚糖酶，而且为提高木聚糖酶活性提供了有效的诱变策略。曹宇帆等以GH11家族木聚糖酶xyn11A-LC为基础，建立随机突变基因文库，从中筛选野生型嗜碱性明显提高的三种突变体，通过蛋白质分子模拟，对分析出的关键位点进行定点突变，最后得到了比野生型嗜碱性明显提高的三种突变体。石敢当等运用计算机分析软件，从已知耐热性能较好的木聚糖酶蛋白序列出发，构建调和序列，合成新型木聚糖酶，再通过计算机软件确定其活性部位，对三级结构进行预测，得出其理论等电点为 6.82，最适温度为81.72℃，均高于改造前的基因。

目前已有大量的研究改造木聚糖酶的酶学性质以适应不同的应用场景，但比活力性也是限制木聚糖酶应用的一个关键指标。木聚糖酶本身的比活力越高，其生产成本就越低，酶的价格也就越低，也将更有利于促进其被广泛的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种碱性木聚糖酶突变体。与野生型相比，所述突变体的比活力得到显著提高，有利于其在造纸等工业领域的广泛应用。