[发明专利]软骨组织脱细胞水凝胶支架及其制备方法与应用

说明书

本发明提供了软骨组织脱细胞水凝胶支架及其制备方法与应用，本发明制备了软骨组织脱细胞水凝胶支架，并成功构建了兔髌骨沟缺损模型，通过软骨组织脱细胞水凝胶支架移植进入模型缺损处，可实现对缺损的有效改善。

技术领域

本发明属于软骨组织工程技术领域，涉及软骨组织脱细胞水凝胶支架及其制备方法与应用。

背景技术

髌骨位于膝关节前方，股骨的下端前面，是人体内最大的籽骨，包埋于股四头肌腱内，为三角形的扁平骨。底朝上，尖向下，前面粗糙，后面为光滑的关节面，与股骨的髌面相关节，参与膝关节的构成。可在体表摸到。髌骨具有保护膝关节，增加膝关节回转能力的功能。髌骨缺损如果不能及时修复将影响膝关节的功能，进而影响生活质量。

目前组织工程学方法为解决关节骨缺损的修复提供了新的途径，如何更接近正常关节软骨的组织结构则是组织工程支架构建过程中的一个重要因素。

发明内容

本发明的目的在于提供软骨组织脱细胞水凝胶支架及其制备方法与应用。

为了实现本发明的目的，本发明采用的技术方案为：

本发明提供了软骨组织脱细胞水凝胶支架的制备方法，包括：

1)制备软骨组织脱细胞，包括：

1-1)将软骨组织切成小块，以纯水冲洗去除杂质；

1-2)洗净后的标本置于液氮10min，结束后在37℃环境下溶解10min，完成5个循环，超声清洗；

1-3)4℃下，将标本在PBS中用0.25％胰蛋白酶处理24小时，每6小时替换一次胰蛋白酶溶液，然后用高渗缓冲溶液洗涤胰蛋白酶消化的软骨标本浆液；

1-4)将标本在37℃下用核酸酶溶液在10mM Tris-HCl，pH 7.5中处理4h；

1-5)将酶处理过的软骨浆液用1％Triton X-100溶液处理24小时后，再用低渗的Tris-HCL溶液洗涤20小时，以除去所有酶；

1-6)1×PBS冲洗标本，纯水冲洗标本，液氮30min，低温粉碎组织，以100目滤网筛选软骨微粒，真空冷冻干燥；

2)制备凝胶：将步骤1)制备好的软骨组织脱细胞支架粉末添加到1mg·mL^-1的胃蛋白酶的0.01M HCl溶液中，支架粉末：胃蛋白酶的重量比为10：1，并在室温下以恒定速度搅拌预定的消化时间，从48小时支架粉末的部分消化产生pH值2～3的中等粘度溶液，通过在冰上中和之前添加适量的1×PBS，制备出浓度较低的支架粉末溶液，通过加入0.01M NaOH溶液和1×PBS分别提供生理酸性和盐度，将中和的胃蛋白酶消化液在37℃下孵育以完成凝胶化；

3)制备凝胶复合支架：在室温下将支架浸泡在制备好的凝胶中4-6h完成复合。

优选地，步骤1-1)中，将软骨组织切成2mm³小块，以纯水冲洗5×3min，以去除杂质。

优选地，步骤1-2)中，超声清洗机功率100W，20℃，20min，清洗3遍。

优选地，步骤1-3)中，高渗缓冲溶液含有1.5M NaCl的50mM Tris-HCl，pH 7.6.

优选地，步骤1-4)中，核酸酶溶液含有50U ml^-1DNAse和1U ml^-1RNAse A。

优选地，步骤1-6)中，1×PBS冲洗标本，5×6min；纯水冲洗标本，5×6min。

本发明还提供了制备方法制备得到的软骨组织脱细胞水凝胶支架。