[发明专利]一种畜产品中莱克多巴胺的检测方法及其应用

说明书

本发明属于畜产品检测领域，涉及莱克多巴胺的检测，特别是指一种畜产品中莱克多巴胺的检测方法及其应用。先将RAC核酸适配体和探针通过退火形成双链后与磁性四氧化三铁结合，当有目标检测物出现时适配体与目标检测物相结合，然后再与修饰有Hp‑Sp探针的AuNPs相结合，在有链亲霉素‑辣根过氧化物酶时观察加入叠氮钠溶液后，颜色由蓝色变为绿色，实现可视化定性检测，在414nm处检测待测溶液的波长对吸光度和克莱多巴胺的浓度之间的关系进行分析，实现定量检测。本申请的检测方法简单、灵敏度高、检测时间短且实现了可视化检测，在实际样品检测中具有较高的应用前景。

技术领域

本发明属于畜产品检测领域，涉及莱克多巴胺的检测，特别是指一种畜产品中莱克多巴胺的检测方法及其应用。

背景技术

莱克多巴胺（Ractopamine）是一种β促效剂（β-agonist）药物。在大量食用含有莱克多巴胺残留的肉类或内脏时，可能引发中毒症状。对此药物在养殖业的适用范围和安全性世界各国的规定不尽相同。

在使用该药物之后，动物的新陈代谢会被改变，促使它们生长出更多的肌肉而不是脂肪，其结果是猪肉变得更加精瘦。因为肌肉比脂肪更重，因此它也使猪更有分量。从表面上看，这就意味着，消费者可以削减饮食中的脂肪，而生产者只需要使用较少的饲料就能养出更重的猪。但莱克多巴胺距离理想的添加剂还差很远，因为它比其他添加剂更易引起问题。2012年一份食品与环境报告中指出，莱克多巴胺的影响包括：“多动、颤抖、四肢无力、无法行走和死亡”。

目前关于莱克多巴胺类抗生素的检测方法有免疫分析法、毛细管电泳法、电化学法、质谱连用法和高效液相色谱法等，其中免疫分析法特异性较高，但存在高背景吸收、操作繁琐（需大量的孵育及洗涤步骤）以及酶易受样品影响等缺点，毛细血管法分析速度快、分离效率高、运行成本低，但技术不是很成熟，且不适用于小分子的检测，质谱连用法和高效液相色谱法需要大型的仪器，价格昂贵。专利CN 103343126A中公开了莱克多巴胺适配体与检测莱克多巴胺的适配体电化学生物传感器，该传感器主要是利用适配体传感器的DPV图谱和峰电流值与浓度的关系进行检测，检测限仅能达到nM级，为了进一步提高检测莱克多巴胺的灵敏度，本项目对莱克多巴胺的适配体、探针及传感器的形式进行了深入的摸索。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出一种畜产品中莱克多巴胺的检测方法及其应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种畜产品中莱克多巴胺的检测方法，步骤如下：

（1）将含有生物素标记的RAC核酸适配体和探针储液，经退火后用Tris-HCl缓冲液稀释，再加入经Tris-HCl缓冲液洗涤后的磁珠，孵育后再洗涤，得经修饰的磁珠，用PBS缓冲液重悬得经修饰的磁珠溶液；

（2）AuNPs溶液与Hp探针溶液、Sp探针溶液和PBS缓冲液混合后的混合液经孵育，离心弃上清再用PBS缓冲液重悬，得修饰有Hp-Sp探针的AuNPs溶液；

（3）步骤（1）的磁珠溶液与待测样品溶液和PBS缓冲液混合后经孵育，所得溶液经PBS缓冲液洗涤后加入步骤（2）的修饰有Hp-Sp探针的AuNPs溶液，再孵育，然后用PBS缓冲液清洗后所得固体再用PBS缓冲液重悬，得样品检测液；

（4）向步骤（3）的样品检测液中加入链亲霉素-辣根过氧化物酶，孵育后用PBS缓冲液清洗后再加入含有ABTS和H₂O₂的醋酸盐缓冲溶液，孵育后加入叠氮钠溶液观察颜色变化，并检测414nm处紫外吸光度；

（5）将步骤（4）测得的吸光度值代入吸光度与莱克多巴胺浓度的线性方程，即得畜产品样品中莱克多巴胺的量。

进一步，所述步骤（1）中含有生物素标记的RAC核酸适配体的序列如SEQ ID No.1所示，其5’端连接有生物素；探针的序列如SEQ ID No.2所示；探针储液的浓度为10μM。