[发明专利]高效生产岩藻糖基乳糖的无抗基因工程菌及其应用

说明书

本发明涉及高效生产岩藻糖基乳糖的无抗基因工程菌及其应用，属于代谢工程和食品发酵领域。本发明采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对底盘微生物进行改造，通过在乳糖合成菌株中重构2’‑FL和3‑FL合成途径、调控中心碳代谢并弱化副产物途径、上调从头合成途径的关键酶，解除阻遏蛋白抑制、增强产物的胞外输出等策略实现无抗基因工程菌的构建和岩藻糖基乳糖的高效合成。本发明得到的重组大肠杆菌可以利用甘油和葡萄糖高效合成岩藻糖基乳糖，发酵过程中不添加抗生素，产物安全无害，生产成本低廉且产物生产水平较高，具有较强的社会经济效益，市场开发前景广阔。

技术领域

本发明涉及高效生产岩藻糖基乳糖的无抗基因工程菌及其应用，属于代谢工程和食品发酵领域。

背景技术

通过绿色生物过程利用廉价生物质生产高附加值产品是实现碳中和和环境友好经济的重要途径。2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)和3-岩藻糖基乳糖(3-FL)是母乳中分泌最丰富的中性岩藻糖基化乳糖(FL)，约占母乳寡糖(HMOs)总量的35％。FL的有益特性(例如维持肠道生态平衡、抵抗病原菌的黏附、免疫调节以及促进神经系统发育和修复)促使其在营养保健和药物用途中的潜在应用而受到了极大的关注。

绿色、高效、安全型底盘微生物的开发是解决HMOs规模化生产和应用的关键。随着代谢工程和合成生物学的发展，诸多模式微生物被发掘作为HMOs生产的潜在微生物细胞工厂。大肠杆菌、酿酒酵母、解脂耶氏酵母和枯草芽孢杆菌等模式微生物已成功用于2’-FL的从头生物合成。当前，3-FL生产菌株常见于大肠杆菌，报道较少且产量偏低。据报道，在厌氧和微有氧条件下，以甘油或葡萄糖为基础的分解代谢在高浓度下可能导致不同的产物(乙酸，乳酸，甲酸等)的产生。副产物的存在使菌株生长减慢或停止，导致目标物的生产速率严重下降或完全停止，因此，消除这些副产物途径在FL的生产中尤为重要。此外，岩藻糖基乳糖的生产需要外源乳糖的供给，乳糖原料成本高，在微生物中开发乳糖合成新技术可以解决FL高效生物合成过程中的乳糖高成本问题。

从宿主菌的选择出发，利用代谢途径重建、弱化竞争途径、辅因子和能量再生、代谢通量优化等策略可以构建具有工业竞争力的FL生产菌株。然而，大部分FL菌株的构建基于质粒基因的过表达。质粒型细胞工厂的开发在发酵过程中存在遗传不稳定和抗生素添加的风险。因此，利用无抗生素和诱导剂的大肠杆菌制备FL已显然成为绿色安全且具备商业价值的生产策略。此前，等人在大肠杆菌JM109菌株带的染色体上引入了2’-FL的从头合成和补救合成途径,在无抗生素的补料分批发酵中产生了20.28±0.83g/L的2’-FL。Parschat等人开发了一种仅以蔗糖为底物的2’-FL生产菌株，该菌株在不添加无抗生素的情况下胞内自产乳糖并用于2’-FL的生产。除此之外，无抗生素和诱导剂的2’-FL生产菌株未见报道。

本发明旨在利用合成生物学手段，通过在乳糖合成菌株中重构2’-FL和3-FL合成途径、调控中心碳代谢并弱化副产物途径、上调从头合成途径的关键酶，解除阻遏蛋白抑制、增强产物的胞外输出等策略实现无抗基因工程菌的构建和岩藻糖基乳糖的高效合成。该研究方法为FL的工业使用提供了菌株安全性和底物灵活性，丰富和发展了微生物代谢调控的技术研究，为重构微生物代谢网络、提高碳原子经济性提供新方法和案例，并为理性设计和构建新一代微生物细胞工厂提供新思路，在理论和实际应用方面均具有较重要价值。

发明内容

[技术问题]

现有技术合成岩藻糖基乳糖效率不高，质粒型菌株表达存在遗传不稳定和抗生素添加的风险，受体乳糖和诱导剂价格昂贵，无法提供安全、高效生产岩藻糖基乳糖的菌株，也不能提供成本低廉且绿色环保的岩藻糖基乳糖的制备方法。

[技术方案]

本发明为了解决岩藻糖基乳糖合成过程中乳糖和诱导剂昂贵、质粒型菌株存在遗传不稳定和抗生素添加的风险等问题，提供了一种高效生产乳糖和岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其构建方法。