[发明专利]高效生产岩藻糖基乳糖的无抗基因工程菌及其应用

权利要求书

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，在宿主细胞中敲除了泛醌依赖性丙酮酸脱氢酶基因poxB，并在泛醌依赖性丙酮酸脱氢酶基因poxB位点处整合了α-1,2-岩藻糖基转移酶基因HpfutC和/或α-1,3-岩藻糖基转移酶基因HpM32；敲除了磷酸乙酰转移酶和乙酸激酶基因簇pta-ackA，并在pta-ackA处整合了磷酸甘露糖变位酶和甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因簇manC-manB；敲除了甲酸裂解酶基因pflB，并在pflB位点整合了GDP-甘露糖-6-脱氢酶和GDP-岩藻糖合成酶基因簇gmd-wcaG；敲除了D-乳酸脱氢酶基因ldhA，并在ldhA位点整合了甘露糖-6-磷酸异构酶基因manA；敲除了乳糖操纵子阻遏蛋白lacI。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述宿主细胞为在大肠杆菌中敲除了β-半乳糖苷酶基因lacZ、UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ、GDP-甘露糖甘露糖基水解酶基因nudD、6-磷酸果糖激酶-1基因pfkA、蛋白酶基因lon，敲除了葡萄糖特异性转运蛋白酶EⅡABC^Glc组件编码基因crr和ptsG，并在crr和ptsG位点分别整合了SetA和Glf；敲除了UDP-葡萄糖-6-脱氢酶基因ugd，并在ugd基因处整合了UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因GalE；敲除了葡萄糖激酶基因Glk，并在葡萄糖激酶基因Glk位点处整合来源于脑膜炎奈瑟球菌的β-1,4-半乳糖基转移酶NmlgtB。

3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶基因HpfutC来源于幽门螺杆菌ATCC 26695，α-1,3-岩藻糖基转移酶基因HpM32来源于幽门螺杆菌NCTC 11639。

4.根据权利要求1～3任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶基因HpfutC、α-1,3-岩藻糖基转移酶基因HpM32、基因簇manC-manB、基因簇gmd-wcaG和甘露糖-6-磷酸异构酶基因manA均利用启动子T7启动表达。

5.根据权利要求1～4任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，使用强启动子T7替换大肠杆菌基因组中manC、manB、gmd-wcaG和manA编码基因的自身启动子。

6.权利要求1～5任一所述的重组大肠杆菌在生产2’-岩藻糖基乳糖和/或3-岩藻糖基乳糖中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，以所述的重组大肠杆菌为发酵菌株，在以甘油、葡萄糖为碳源的发酵体系中生产2’-岩藻糖基乳糖和/或3-岩藻糖基乳糖。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述重组大肠杆菌接种于摇瓶发酵培养基，发酵初始时加入终浓度为8g/L的葡萄糖，在30～40℃，150～250rpm条件下培养72h。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在发酵罐中添加发酵培养基，接种所述的重组大肠杆菌进行发酵；所述发酵体系中含有甘油20～30g/L，5～10g/L的葡萄糖，磷酸二氢钾10～15g/L，柠檬酸1～2g/L，磷酸氢二氨3～5g/L，七水硫酸镁1～2g/L，酵母提取物8～10g/L，微量金属溶液8～10mL/L。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述基因工程菌在20～40℃培养，维持发酵体系中的溶氧为30±5％，pH为6.5～7.0；待初始葡萄糖消耗完后补加葡萄糖，使发酵体系中葡萄糖浓度维持在10±0.5g/L。