[发明专利]一种母菊中新型α-甜没药醇合成酶(MrBAS)启动子的特性及功能分析的方法有效

专利信息
申请号: 202210974067.X 申请日: 2022-08-15
公开(公告)号: CN115287287B 公开(公告)日: 2023-10-24
发明(设计)人: 许锋;叶家保;郑嘉瑞;张威威;廖咏玲;王莉娜;王启剑;陈强文 申请(专利权)人: 长江大学
主分类号: C12N15/113 分类号: C12N15/113;C12N15/84;C12N15/56;A01H5/02;A01H5/12;A01H6/20;A01H6/82
代理公司: 杭州研基专利代理事务所(普通合伙) 33389 代理人: 肖竹芸
地址: 434023*** 国省代码: 湖北;42
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摘要:
搜索关键词: 一种 母菊中 新型 没药 合成 mrbas 启动子 特性 功能分析 方法
【说明书】:

发明公开了一种母菊中新型α‑甜没药醇合成酶(MrBAS)启动子的特性及功能分析的方法,通过TAIL‑PCR染色体步移技术从母菊(Matricaria recutita)基因组中克隆得到α‑甜没药醇合成酶基因(MrBAS)转录起始位点上游1327bp的启动子序列。顺式作用元件分析发现其含有TATA‑box、CAAT‑box、MYB、MYC结合位点、植物激素、金属离子、细胞周期、光响应和紫外响应等序列。根据启动子功能元件位置,构建了6个不同长度片段的BAS启动子表达载体,结果表明BAS启动子序列能驱动GUS基因在烟草叶片中的表达,并随着启动子片段的减小,GUS酶活性降低。在转基因拟南芥中分析发现MrBAS启动子序列能驱动GUS基因在拟南芥的花药、花粉管和花瓣中特异表达,表达具有组织特异性。

技术领域

本发明属于植物分子生物学和生物工程技术领域,具体涉及一种母菊中新型α-甜没药醇合成酶(MrBAS)启动子的特性及功能分析的方法。

背景技术

母菊(Matricaria recutita L.)为菊科甘菊属最常见的药用植物之一,原产于南欧和东欧,被世界26个国家的药典收录。母菊是一种应用广泛的香草植物和药用植物,含有挥发性芳香油,因具有独特的香气和药理作用而广泛应用于园林绿化、食品、化妆品、医药等领域中。通过对母菊活性成分的研究发现,其挥发油主要成分是母菊薁和α-甜没药醇(α-bisabolol)及其氧化物。

α-甜没药醇是一种倍半萜化合物,药理学研究证明α-甜没药醇具有消炎、灭菌、愈合溃疡、溶解胆石等药效。此外,α-甜没药醇还具有良好的护肤作用,作为化妆品的重要添加成分广泛应用。因此,增加母菊中α-甜没药醇含量可显著提高母菊药材的质量和经济价值。大量研究表明,利用基因工程技术提高次生代谢中关键基因的表达量是提高目标产物的有效途径。因此,针对母菊α-甜没药醇合成途径中的关键基因进行遗传改良是提高其含量的有效策略。

发明内容

本发明的目的是针对现有的问题,提供了一种母菊中新型α-甜没药醇合成酶(MrBAS)启动子特性及功能分析的方法,一种基于TAIL-PCR染色体步移技术从母菊基因组中克隆α-甜没药醇合成酶基因启动子和不同片段启动子活性及启动子表达模式分析。

本发明是通过以下技术方案实现的:

一种母菊中新型α-甜没药醇合成酶(MrBAS)启动子的特性及功能分析的方法,所述方法包括:

步骤1:通过TAIL-PCR染色体步移技术从母菊中克隆α-甜没药醇合成酶基因的启动子序列;解决了因没有基因组序列而无法克隆启动子的限制;

步骤2:将步骤1中克隆到的启动子序列进行一代测序获得MrBAS基因启动子的碱基序列,实现了后续启动子的顺式作用元件分析、不同片段启动子的克隆,进行后续启动子分析和不同片段启动子克隆引物设计;

步骤3:通过Gataway的方法将克隆得到的MrBAS启动子全长及5个不同片段构建到表达载体pKGWFS7上与GUS形成融合表达载体pKGWFS7-BAS,同时以pKGWFS7作为负对照,以pKGWFS7-35S作为正对照;

步骤4:将步骤3构建的表达载体pKGWFS7-BAS、pKGWFS7和pKGWFS7-35S转入农杆菌LBA4404,便于烟草的瞬时表达和拟南芥的转化;

步骤5:对步骤4中含有不同MrBAS启动子片段的农杆菌通过注射烟草叶片来验证不同长度启动子的活性;对步骤4中含有MrBAS全长启动子的农杆菌通过花絮侵染法获得转基因拟南芥,来验证启动子的特异性表达;

步骤6:对步骤5注射的烟草进行GUS活性检测分析不同片段启动子的活性;对转基因拟南芥进行GUS染色和活性分析,来验证启动子活性强弱。

本发明相比现有技术具有以下优点:

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