[发明专利]一种鼠源的表皮黑色素细胞的制备方法

说明书

本发明涉及一种鼠源的表皮黑色素细胞的制备方法。其中细胞的制备方法包括如下步骤：酶消化分离表皮组织；表皮黑色素细胞原代、传代培养及纯化。实验证实，采用本发明的方法分离出纯表皮组织，并通过组织分离培养，获得高纯度表皮黑色素细胞。本发明所用实验材料易于获得，实验方法简便高效，且本发明通过原代组织培养可获得高纯度的正常黑色素细胞，经形态学观察，符合黑色素细胞特征，细胞纯度达到90％以上。可为进一步研究黑色素转运机制，机体内的相关基因、蛋白及信号通路的调节，提供基础性材料支持。

技术领域

本发明涉及细胞组织工程技术领域，特别是涉及一种鼠源的表皮黑色素细胞的制备方法。

背景技术

黑色素瘤作为常见的恶性肿瘤，是一种死亡率极高的疾病，属于皮肤癌症之一。黑色素瘤主要起源于皮肤中的黑色素细胞，黑色素细胞决定机体肤色，该细胞的主要生理功能是产生黑素小体，进而形成并转移黑色素，黑素小体对于机体皮肤具有重要的保护作用，可以避免皮肤受到损害。分泌的黑色素具有吸收紫外光，、参与偶联氧化还原反应、清除自由基和离子存储等功能。当皮肤中黑色素的合成代谢出现异常时，机体则会出现恶性黑色素瘤、白癜风、帕金森病、皮肤色素沉着病以及老年斑等可能性疾病。黑色素瘤细胞增长速率快，治愈率低，相关研究在现代医学水平上还存在很多未知，因此，进一步研治恶性皮肤肿瘤疾病丞待完善。

黑色素细胞作为皮肤癌症疾病中的基础性实验材料，黑色素细胞培养技术方法的建立是实验研究者所关注的。迄今为止，实验者无法在短时间内获得大量生长状态良好的高纯度黑色素细胞，在这种情况下，就需要一种利用组织分离培养，从而获得高纯度表皮黑色素细胞的方法。

原代培养通过组织分离，利用合适的酶进行组织消化，获得细胞悬液，经过原代、传代培养以及纯化，从而获得高纯度目的细胞。目前人们对于黑色素细胞分化调控机制仍在进一步探索中。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种鼠源的表皮黑色素细胞的制备方法。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

一种鼠源的表皮黑色素细胞的制备方法，包括：

获取乳鼠的背部皮肤；

对所述背部皮肤依次进行清洗、剪切、消化分散、冷消、剥离和润洗，得到表皮组织块；

对所述表皮组织块进行剪碎处理，得到剪碎的表皮组织；

对所述剪碎的表皮组织进行消化离心和过滤，得到沉淀；

在所述沉淀中加入5ml MElM培养基，重悬细胞，加入到T25培养瓶中，放入37℃，含5％CO₂培养箱中进行培养；

检测所述T25培养瓶中的细胞融合度，若所述细胞融合度大于等于90％时，对所述T25培养瓶中的细胞进行离心处理，弃上清并进行润洗，润洗后再次弃上清；

向所述T25培养瓶内加入1ml的胰蛋白酶-EDTA溶液，并置于37℃，5％的CO₂温箱3min后，倒置显微镜进行观察，若观察到细胞回缩，细胞间隙增大，则再向所述T25培养瓶内加入3ml中和液终止消化；

用吸管反复吹打所述T25培养瓶的瓶底，以使细胞脱落；

收集细胞悬液，在1000rpm条件下，离心5min，弃上清，得到细胞沉淀；

将所述细胞沉淀用培养基重悬，重铺到T25培养瓶中进行培养；

在24h后更换培养基；更换后的培养基中生长出的细胞为表皮黑色素细胞。

优选地，所述获取乳鼠的背部皮肤，包括：

获取出生1至3天的健康乳鼠；