[发明专利]一种落羽杉胚性愈伤组织的超低温冷冻保存方法

说明书

本发明公开了一种落羽杉胚性愈伤组织的超低温冷冻保存方法，属于植物组培技术领域。本发明具体方法包括：挑取并轻轻按压落羽杉胚性愈伤组织，加入液体培养基，制备为胚性愈伤组织细胞悬浮液；脱水剂和冷冻保护剂处理悬浮液；对悬浮液进行程序降温冷冻；冷冻降温完成后保存至液氮环境中；从液氮中取出冷冻材料，解冻后进行恢复生长，检测愈伤组织细胞活性。本发明所述的超低温冷冻保存方法，操作步骤简单，处理液配方简单且成本低，为后期中山杉优良品系胚性愈伤组织的保存提供了技术条件。

技术领域

本发明属于植物组培技术领域，具体涉及一种落羽杉胚性愈伤组织的超低温冷冻保存方法。

背景技术

落羽杉(Taxodium distichum(L.)Rich.)为柏科落羽杉属的古老孑遗植物，其树形高大优美，叶片秀丽似羽毛，生长速度快且适应性强，拥有极强的耐水淹能力，广泛应用于景观绿化和生态防护。通过落羽杉属种间杂交选育的‘中山杉’系列无性系已经在我国东部沿海滩涂造林、长江流域湿地生态修复和内陆平原地区造林绿化工程中得到广泛应用，市场需求愈来愈大。体细胞胚胎发生技术具有繁殖数量多、速度快等优点，在大规模无性繁殖中表现出高效性和经济性，是实现市场需求大、常规繁殖技术困难的优良苗木模式化生产的重要手段。

落羽杉的胚性愈伤组织每20天就需继代一次，成本较高。更重要的是，长期继代会造成胚性愈伤组织的细胞变异以及胚性丧失，研究表明，超低温冷冻保存可以避免连续继代培养造成的不利影响，从而实现种质资源的长期保存。在超低温冷冻环境下，植物细胞中的各种酶活受到抑制，新陈代谢停止，恢复到常温环境下即可正常生长。迄今为止，有关落羽杉属的超低温冷冻保存方法尚未见报道，限制了落羽杉及中山杉优良种质资源的长期保存，因此，建立落羽杉的超低温冷冻保存方法至关重要。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于：针对落羽杉或不同品系中山杉的种质资源保存，提供一种操作简单且成本低的超低温冷冻保存方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种落羽杉胚性愈伤组织的超低温冷冻保存方法，包括：

1)挑取并轻轻按压落羽杉胚性愈伤组织，加入液体培养基，制备为胚性愈伤组织细胞悬浮液；

2)向胚性愈伤组织细胞悬浮液中加入甘露醇进行高渗脱水处理；

3)脱水处理完成后，向胚性愈伤组织细胞悬浮液中加入冷冻保护剂DMSO，再将其分装到冻存管中，置于冰上静置，静置结束后进行程序降温冷冻；

4)将冻存管保存至液氮环境中。

优选地，步骤1)中，所述液体培养基的配方为DCR+2，4-D 1～2mg/L+6-BA 0.2～0.5mg/L+VC 10mg/L+谷氨酰胺0.4～0.6g/L+水解酪蛋白0.5～1.0g/L+活性炭2.0～2.5g/L+麦芽糖20～25g/L。

优选地，步骤1)中，所述胚性愈伤组织细胞悬浮液的细胞密度为0.4g/mL～0.6g/mL。

优选地，步骤2)中，胚性愈伤组织细胞悬浮液中甘露醇的终浓度为0.2～0.8M。

优选地，步骤2)中，高渗脱水处理时间为6～24h。

优选地，步骤3)中，胚性愈伤组织细胞悬浮液中DMSO终浓度为2.5％～10％。

优选地，步骤3)中，冰上静置时间为20～80min。

优选地，步骤3)中，冻存管在降温仪中以1℃/min的速度降温。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：