[发明专利]一种检测和筛选细胞壁靶向抗生素的全细胞微生物传感器

说明书

本发明利用革兰氏阴性细菌奥奈达希瓦氏菌中能够感知和应答细胞壁损伤的双组分系统PghK/PghR及其调控的靶基因启动子P_blaA构建一种全细胞微生物传感器。本发明构建的全细胞微生物传感器能够特异性响应细胞壁靶向抗生素，通过双组分系统PghK/PghR进而激活由P_blaA驱动的报告基因表达；对β‑内酰胺酶基因blaA进行敲除显著提升全细胞微生物传感器的灵敏度；在固体平板中该全细胞微生物传感器同样具有优良的响应性能。因此，本发明构建的全细胞微生物传感器能够用于细胞壁靶向抗生素的检测以及细胞壁靶向抗生素产生菌的筛选，对新型抗生素的发现具有重要意义。

一、技术领域

本发明涉及一种基于细菌双组分系统构建的全细胞微生物传感器，及其检测和筛选细胞壁靶向抗生素的方法，本发明属于生物技术领域。

二、背景技术

近年来，由于抗生素的不合理使用甚至滥用导致细菌耐药性问题日益凸显，严重影响了抗生素的临床疗效。与革兰氏阳性菌相比，革兰氏阴性菌的耐药问题尤其值得关注，数十年来没有新的抗生素被批准用于治疗革兰氏阴性细菌引起的感染。2017年，世界卫生组织发布了亟需研发新型抗生素的12种(类)耐药菌清单中，8种(类)是革兰氏阴性菌。因此，迫切需要新的筛选方法来寻找有效针对革兰氏阴性菌的新型抗生素。

细胞壁是绝大多数细菌所特有的结构，并且人体及动物细胞中不含有细胞壁，这使得细胞壁成为最重要的抗生素作用靶点。目前许多常用的抗生素都能特异性靶向细胞壁，如青霉素类和碳青霉素类等β-内酰胺类、万古霉素、D-环丝氨酸等。最新的研究发现了两类作用机制独特的细胞壁靶向抗生素(corbomycin和complestatin)，它们抑制细胞壁的水解而非合成。另外，近年来发现的SEDS家族蛋白是细菌中保守的细胞壁合成酶，可以作为抗生素开发的优良靶点。因此，自然界中仍有许多靶向细胞壁的抗菌药物仍有待进一步发现。

合成生物学通过整合多学科的研究思路，对已有的生物系统进行改造或设计，合成自然界不存在的人工系统。其研究领域之一是利用生物体中原有的信号转导调控系统构建全细胞微生物传感器，从而实现对新型药物的筛选。双组分系统是微生物感知和应答外界信号的最重要的一类信号转导系统，由组氨酸激酶和应答调控蛋白二元组分构成。当组氨酸激酶感知信号后自磷酸化，然后将磷酸基团传递给胞内的应答调控蛋白，磷酸化的应答调控蛋白构象发生变化，从而与下游靶基因启动子结合，调节基因的表达水平。

目前，国内外发明的用于检测和筛选抗生素的全细胞微生物传感器主要包括两类：一类是特异性针对某一种类型抗生素的，如β-内酰胺类、四环素类和大环内酯类等全细胞微生物传感器；另一类是针对某一条生物合成途径的，如靶向革兰氏阳性菌细胞壁生物合成和细菌胞膜生物合成的全细胞微生物传感器。然而目前尚无特异性靶向革兰氏阴性菌中细胞壁生物合成的全细胞传感器。

本发明基于一种在革兰氏阴性菌(奥奈达希瓦氏菌)中发现的能够感知和应答细胞壁靶向抗生素的双组分信号转导系统PghK/PghR，构建特异性检测和筛选细胞壁靶向抗生素的全细胞微生物传感器，对于新型抗生素的发现具有重要意义。

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