[发明专利]靶向膜联蛋白A1的纳米抗体及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种靶向膜联蛋白A1的纳米抗体及其制备方法与应用，公开了一种靶向膜联蛋白A1的纳米抗体，所述纳米抗体包括纳米抗体Nb6，其中，所述纳米抗体Nb6的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示，提供的纳米抗体Nb4为与膜联蛋白A1就具有较高的亲和力，通过该抗体可靶向作用于膜联蛋白A1，与膜联蛋白A1高强度的结合能力，有利于开发与膜联蛋白A1的纳米抗体相关药物，实现对肿瘤进行靶向治疗和成像，具有非常大的临床应用价值。同时能够以该纳米抗体为基础制备分子探针，通过与肿瘤血管表面膜联蛋白抗原特异性结合，应用于肿瘤进行特异性成像和诊断；并且用于相关药物的递送，应用十分广泛。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种靶向膜联蛋白A1的纳米抗体及其制备方法与应用。

背景技术

药物是否有效取决于药物能否在靶标部位聚集并且发生作用。多数肿瘤化疗药物的治疗效果差以及毒副作用主要是因为药物的靶向性弱。针对不同肿瘤特异性高表达的蛋白设计靶点，能够让药物快速的聚集到靶点，降低药物的毒副作用。

膜联蛋白A1(Annexin A1,ANXA1)是一种受钙离子调节的磷脂结合蛋白，属于Ca²⁺依赖蛋白。人ANXA1由346个氨基酸(37Kda)组成。ANXA1蛋白在部分肿瘤细胞中大量表达，并且参与肿瘤细胞生存、增殖、凋亡、分化和迁移，它与肿瘤的起始、增殖和转移有关。ANXA1存在三个亚细胞定位：一个细胞质，第二个是细胞核，第三个是松散或紧密地附着在细胞膜上；针对不同的位置，ANXA1以不同的方式参与肿瘤的的发生，甲酰基多肽受体(Formylpeptide receptor,FPR)受体，是唯一已知的外分泌ANXA1受体；许多研究发现ANXA1/FPR复合体参与炎症、神经内分泌系统、调节骨骼肌分化和癌症进展，FPR可以被ANXA1激活，也可以被来自其N-末端区域的合成肽激活，由于这些受体可以被各种合成的配体激活或沉默，它们是一个非常有吸引力的药理靶标家族。

其次，在人类的肿瘤中的血管内皮细胞膜中会形成小凹，小凹是一种特殊类型的脂筏，在许多细胞类型中，特别是在内皮细胞中，小凹是质膜的小内陷(50-100nm)。它们经常与压力纤维联系在一起，以确保分子运输到细胞内，更重要的是穿过细胞。结果表明，内皮细胞小窝中表达的靶向蛋白可以将静脉注射的抗体特异性泵入肺内。ANXA1在人类肿瘤(乳腺、肾脏、肝脏、肺、脑和前列腺)的小窝中表达，在肿瘤微循环的管腔表面表达，但在正常血管中不表达。某些学者通过ANXA1全长抗体偶联Alexa Fluor488或者用放射性物质125I用于肿瘤血管成像以及治疗。这些潜在的发现表明ANXA1有望成为人类肿瘤成像、药物输送和内部放射治疗的靶点。

然而，目前没有与ANXA1蛋白高强度结合的纳米抗体，导致ANXA1蛋白靶点的有益性质得不到广泛的应用。

发明内容

本申请的目的在于提供一种靶向膜联蛋白A1的纳米抗体及其制备方法与应用，旨在解决现有技术中缺乏可靶向膜联蛋白A1的纳米抗体，以至于无法更好地利用膜联蛋白A1靶点进行相关药物制备的问题。

为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：

第一方面，本申请提供了一种靶向膜联蛋白A1的纳米抗体，所述纳米抗体包括纳米抗体Nb4，其中，所述纳米抗体Nb4的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示。

第二方面，本申请提供了一种靶向膜联蛋白A1的纳米抗体的制备方法，包括如下步骤：

将膜联蛋白A1进行表达纯化，得到膜联蛋白A1目的蛋白；

将所述膜联蛋白A1目的蛋白包被在免疫管上进行富集筛选，得到噬菌体文库；

将所述噬菌体文库的洗脱液进行PCR扩增并进行ELISA验证，再进行二代测序，并根据测序结果合成纳米抗体的基因序列；