[发明专利]一种基于Tn558转座子构建的能表达荧光的自杀型质粒、构建方法及应用

权利要求书

1.一种基于Tn558转座子构建表达荧光的自杀型质粒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、扩增或合成以下片段：

片段一：Tn558的编码转座酶基因tnpABC；

片段二：pLZ002的编码绿色荧光蛋白基因sfGFP；

片段三：氟苯尼考耐药基因fexA；

将以上三段片段电泳并分别回收；将回收后的三段片段按照摩尔比为1:1:1的比例进行重叠PCR后电泳，并回收片段大小为7333bp的产物；

S2、将质粒pZ-oriTRP4通过BamHI单酶切，然后电泳并回收片段大小为2825bp的产物；

S3、将步骤S1中的最终PCR产物和步骤S2质粒酶切后产物进行重组，得到pTn558-GFP-oriTRP4质粒。

2.根据权利要求1所述一种基于Tn558转座子构建表达荧光的自杀型质粒的方法，其特征在于，步骤S1和步骤S2所述电泳为琼脂糖凝胶电泳，步骤S3所述重组采用无缝克隆酶。

3.一种能表达荧光的自杀型质粒，其特征在于：通过权利要求1或2所述的方法构建得到。

4.权利要求3所述的一种能表达荧光的自杀型质粒在构建金黄色葡萄球菌荧光菌株中的应用。

5.一种基于Tn558转座子构建金黄色葡萄球菌荧光菌株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将权利要求3所述能表达荧光的自杀型质粒转化至大肠杆菌WM3064感受态细胞，得到荧光标记的大肠杆菌供体菌；

S2、将步骤S1中得到的大肠杆菌供体菌和金黄色葡萄球菌受体菌分别培养至对数生长期；

S3、将步骤S2中获得的对数生长期的大肠杆菌供体菌和金黄色葡萄球菌受体菌混合均匀后加入到培养基中培养，得到改造后的金黄色葡萄球菌荧光菌株。

6.根据权利要求5所述的一种基于Tn558转座子构建金黄色葡萄球菌荧光菌株的方法，其特征在于，

步骤S2所述供体菌培养所用培养基为含50μg/mL二氨荃庚二酸的LB肉汤培养基；

步骤S2所述受体菌培养所用培养基为LB肉汤培养基；

步骤S3所述培养基为含50μg/mL二氨荃庚二酸的LB肉汤培养基。

7.根据权利要求5所述的一种基于Tn558转座子构建金黄色葡萄球菌荧光菌株的方法，其特征在于，还包括采用小动物活体成像仪和/或PCR的方法对步骤S1中得到荧光大肠杆菌供体菌进行鉴定的步骤，所述的采用小动物活体成像仪进行鉴定的步骤如下：用小动物活体成像仪照射菌株，若在小动物活体成像仪照射下有荧光的菌株，即为荧光的大肠杆菌供体菌株。

8.根据权利要求5所述的一种基于Tn558转座子构建金黄色葡萄球菌荧光菌株的方法，其特征在于，还包括对步骤S3得到荧光菌株进行验证的步骤，所述验证步骤包括：将改造后的荧光菌株涂布于含有氟苯尼考的LB琼脂培养基中，然后将其置于37℃条件下进行培养，用荧光成像系统或动物成像系统观察到有荧光的菌株，即为改造成功的荧光菌株。

9.一种基于Tn558转座子构建的能表达荧光的金黄色葡萄球菌菌株，其特征在于，通过权利要求5-8任一项所述的方法构建得到。

10.权利要求1-2任一项所述的基于Tn558转座子构建能表达荧光的自杀型质粒的方法或权利要求5-8任一项所述的基于Tn558转座子构建金黄色葡萄球菌荧光菌株的方法在构建荧光菌株、构建耐药荧光菌株、药动药效学评价或筛选药物中的应用。