[发明专利]一种先导编辑gRNA的产生方式及其用途

说明书

本发明公开了一种先导编辑gRNA的产生方式及其用途，本发明提供一种先导编辑gRNA的产生方式，使用RNA聚合酶II类启动子转录先导编辑所需的pegRNA和nicking sgRNA。本发明使用RNA聚合酶II类启动子代替传统的RNA聚合酶III类启动子，来产生包含于内含子中的先导编辑gRNA，得到了新型先导编辑工具p2PE3，利用Doxycycline来控制先导编辑gRNA的产生，从而实现可控的先导编辑，这将有利于进一步扩大先导编辑工具的实用性。

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，尤其涉及一种先导编辑gRNA的产生方式及其用途。

背景技术

先导编辑(Prime editing,PE)工具由Cas9切口酶与工程化的逆转录酶组成，并对应一条pegRNA和一条nicking sgRNA。pegRNA和普通sgRNA不同，它的3’端还带有一段结合引物(Primer Binding Site，PBS)和供修复所需的模板(Reverse Transcriptiontemplate，RTT)。逆转录酶利用PBS和RTT进行反转录得到修复的DNA，从而利用这段DNA进行定向突变。nicking sgRNA通过在未编辑链引入一个切口，大大增加了PE的编辑效率，可以在所需位点精确引入点突变，小插入或小缺失。

但先导编辑也并非完美无瑕，主要的限制便是它的编辑效率。在人类细胞系上的测试显示，先导编辑在不同细胞系中的编辑效率差距比较大，并且不同位点的编辑效率差距也比较大。Liu等人和Nelson等人发现pegRNA的3’末端会很大影响效率，主要是因为3’末端容易被降解以及会和5’端形成互补配对，影响Cas9的结合。Liu等人通过在pegRNA的3’末端添加了一个Csy4识别位点的茎环结构，并和nicking sgRNA相连，再通过外源表达的Csy4核酸内切酶进行切割，能大大提高先导编辑的效率，该系统命名为ePE3。

然而，ePE3的gRNA是通过RNA聚合酶III类(Pol III)启动子产生的，这就导致该系统具有以下问题。首先，Pol III的转录会很容易地被四到六个连续的U残基终止，因此它不适合对sgRNA上含有poly(T)的位点进行编辑；其次，Pol III启动子会在sgRNA的5’末端添加额外的鸟嘌呤或腺嘌呤，导致5’末端的sgRNA与DNA错配，影响高保真SpCas9变异的效率；最后，Pol III启动子是组成型表达，因此无法控制gRNA的产生。

为此，我们提出一种先导编辑gRNA的产生方式及其用途。

发明内容

本发明为了解决上述技术问题，提供一种先导编辑gRNA的产生方式及其用途。

本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供一种先导编辑gRNA的产生方式，使用RNA聚合酶II类启动子转录先导编辑所需的pegRNA和nicking sgRNA。

本发明第二方面提供一种分离的核酸，由本发明第一方面所述一种先导编辑gRNA的产生方式产生的前体RNA，包括：

(i)两个外显子，分为第一外显子和第二外显子；

(ii)先导编辑所需的pegRNA和nicking sgRNA；

(iii)三段Csy4识别位点，分为第一Csy4识别位点、第二Csy4识别位点和第三Csy4识别位点；

(iv)一段包含(ii)和(iii)的内含子；

所述前体RNA组成顺序依次为：第一外显子、内含子序列的前半段、第一Csy4识别位点、pegRNA、第二Csy4识别位点、nicking sgRNA、第三Csy4识别位点、内含子序列的后半段、第二外显子。

进一步地，所述前体RNA包含的Csy4核酸内切酶识别序列包括：

(a)如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或，