[发明专利]一种先导编辑gRNA的产生方式及其用途

权利要求书

1.一种先导编辑gRNA的产生方式，其特征在于，使用RNA聚合酶II类启动子转录先导编辑所需的pegRNA和nicking sgRNA。

2.一种分离的核酸，其特征在于，由权利要求1所述一种先导编辑gRNA的产生方式产生的前体RNA，包括：

(i)两个外显子，分为第一外显子和第二外显子；

(ii)先导编辑所需的pegRNA和nicking sgRNA；

(iii)三段Csy4识别位点，分为第一Csy4识别位点、第二Csy4识别位点和第三Csy4识别位点；

(iv)一段包含(ii)和(iii)的内含子；

所述前体RNA组成顺序依次为：第一外显子、内含子序列的前半段、第一Csy4识别位点、pegRNA、第二Csy4识别位点、nicking sgRNA、第三Csy4识别位点、内含子序列的后半段、第二外显子。

3.如权利要求2所述的一种分离的核酸，其特征在于，所述前体RNA包含的Csy4核酸内切酶识别序列包括：

(a)如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或，

(b)与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有95％以上同一性、且维持被Csy4核酸内切酶识别的功能。

4.一种gRNA重组表达载体，其特征在于，表达如权利要求2所述的一种分离的核酸。

5.一种引导编辑工具，其特征在于，包括：

(i)一种融合蛋白，包括一个先导编辑器与一种核酸内切酶；

(ii)一种如权利要求2所述的一种分离的核酸。

6.如权利要求5所述的一种引导编辑工具，其特征在于，所述先导编辑器的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

7.如权利要求5所述的一种引导编辑工具，其特征在于，所述核酸内切酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

8.如权利要求5所述的一种引导编辑工具，其特征在于，所述融合蛋白使用P2A片段连接先导编辑器与核酸内切酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

9.一种分离的编码核酸，其特征在于，编码如权利要求5所述的一种引导编辑工具中的一种融合蛋白。

10.一种编辑器重组表达载体，其特征在于，表达如权利要求9所述的一种分离的编码核酸。

11.一种表达系统，其特征在于，包含如权利要求4所述的一种gRNA重组表达载体或如权利要求10所述的一种编辑器重组表达载体，所述表达系统的宿主细胞为真核细胞或原核细胞。

12.如权利要求11所述的一种表达系统，其特征在于，所述真核细胞或原核细胞为人细胞的真核细胞。

13.如权利要求12所述的一种表达系统，其特征在于，所述人细胞的真核细胞为人胚胎肾细胞、人胚胎干细胞、人宫颈癌细胞或人骨肉瘤细胞。

14.如权利要求13所述的一种表达系统，其特征在于，所述人胚胎肾细胞、人胚胎干细胞、人宫颈癌细胞或人骨肉瘤细胞为HEK293T细胞、H1 hESC细胞、Hela细胞或U2OS细胞。

15.如权利要求1所述的一种先导编辑gRNA的产生方式、如权利要求2-3任一项所述的一种分离的核酸、如权利要求4所述的一种gRNA重组表达载体、如权利要求5-8任一项所述的一种引导编辑工具、如权利要求9所述的一种分离的编码核酸、如权利要求10所述的一种编辑器重组表达载体、如权利要求11-14任一项所述的一种表达系统在真核生物基因编辑中的用途。

16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述用途包括编辑pegRNA或nickingsgRNA上含有poly(T)的位点、实现组合编辑以及实现条件性或组织特异性编辑。