[发明专利]游离睾酮的检测方法

权利要求书

1.一种游离睾酮的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、在包括底板和平衡透析膜的平衡透析系统中，加入待测血清样品、生理盐水和透析缓冲液，封膜后进行透析；

(2)、透析结束后，在透析液中加入内标工作液，加入甲基叔丁基醚，振荡后离心；冷冻后取上清，氮气吹干，复溶，进行液相色谱-质谱检测。

2.根据权利要求1所述的游离睾酮的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述待测血清样品占待测血清样品与生理盐水体积和的50％～90％；和/或所述血清样品和生理盐水的体积和，与所述透析缓冲液的体积比为1：0.9～1.1。

3.根据权利要求2所述的游离睾酮的检测方法，其特征在于，所述待测血清样品占待测血清样品与生理盐水体积和的50％～60％。

4.根据权利要求1所述的游离睾酮的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述液相色谱条件包括：色谱柱：C18柱；进样量为：45μL～55μL，流速为：0.3ml/min～0.5ml/min；柱温：30.0±2℃；流动相A为甲醇，流动相B为质谱级水；所述液相色谱的洗脱程序为：

0～4.5min，流动相A48-65％，流动相B 52-35％；

4.5～5.8min，流动相A 65％，流动相B 35％；

5.8～5.81min，流动相A65％→100％，流动相B 35％→0％；

5.81～6.50min，流动相A 100％，流动相B 0％；

6.50～6.51min，流动相A 100％→58％，流动相B 0％→42％；

6.51～8.00min，流动相A 58％，流动相B42％。

5.根据权利要求1～4任一项所述的游离睾酮的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述透析缓冲液包括以下浓度的组分：HEPES 12.5±0.5g/L，NaCl 0.90±0.10g/L，NaOH 5.4±0.1g/L，KH₂PO₄0.2±0.1g/L，KCl 0.20±0.1g/L，MgSO₄·7H₂O0.3±0.1g/L，尿素0.3±0.1g/L，CaCl₂·2H₂O 0.3±0.1g/L，pH7.3～7.5，所述透析缓冲液的制备方法包括：配制透析缓冲液后，采用≤0.22μm的水相针式过滤器进行过滤。

6.根据权利要求1～4任一项所述的游离睾酮的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述底板的材质为聚四氟乙烯。

7.根据权利要求6所述的游离睾酮的检测方法，其特征在于，所述底板的清洗方法包括：流动的自来水反复冲洗底板，再使用去离子水超声清洗12分钟～18分钟，使用45％～55％乙醇水超声清洗25分钟～35分钟，再使用纯乙醇反复冲洗2次～4次，自然晾干。

8.根据权利要求1～4任一项所述的游离睾酮的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，在透析结束后，还包括监测透析液是否存在蛋白泄露的步骤；所述监测透析液是否存在蛋白泄露的方法包括：观察透析液是否有颜色变化；和/或观察透析液是否存在气泡，以及所述气泡通过静置是否消除。

9.根据权利要求1～4任一项所述的游离睾酮的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述质谱检测的离子源为电喷雾离子源，在正离子模式下，采用多反应监测模式；

游离睾酮定量离子对的质荷比为：母离子289.2，子离子97.0；

游离睾酮定性离子对的质荷比为：母离子289.2，子离子109.0；

内标离子对1的质荷比为：母离子292.2，子离子100.042；

内标离子对2的质荷比为：母离子292.2，子离子112.047。

10.根据权利要求1～4任一项所述的游离睾酮的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述平衡透析膜的分子截断量为6KDa～10KDa；和/或所述透析包括：35℃～38℃，200rpm～300rpm条件下，恒温孵育3h～5h。