[发明专利]埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白及其编码基因和制备方法

说明书

本发明涉及肝素酶融合蛋白制备技术领域，具体涉及埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白及其编码基因和制备方法。埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白，包括肝素酶I和麦芽糖结合蛋白，肝素酶I和麦芽糖结合蛋白之间连接有连接肽，所述连接肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.11或者SEQ ID NO.12所示。本方案可以解决使用生物工程技术获得的肝素酶的酶活性有限的技术问题，对建立表达效率高、酶活性高的肝素酶重组表达系统具有重要的理论和现实意义。

技术领域

本发明涉及肝素酶融合蛋白制备技术领域，具体涉及埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白及其编码基因和制备方法。

背景技术

肝素酶(heparinase)是一类作用于肝素或者乙酰肝素分子的多糖裂解酶，分别为肝素酶I、II、III。肝素酶主要从一些利用肝素为碳源的细菌中分离得到，最初来源于肝素黄杆菌(Flavobacteriumheparinum)，此外，在许多微生物中也发现了肝素酶的存在，但至今肝素黄杆菌仍然是商品肝素酶的唯一来源。

自上世纪九十年代开始，已有大量的肝素酶I的基因工程表达研究和实践，其中以大肠杆菌为宿主的异源表达研究和应用最多。但是，在大肠杆菌中的表达肝素酶I，容易聚集成不溶性包涵体，形成包涵体肝素酶I很难再复性。此外，许多融合表达策略已被用于改善肝素酶I的生产。但是，针对肝素酶I的融合蛋白的研究，都是以肝素黄杆菌来源的肝素酶I为研究对象，并且表达的肝素酶I的活性和产量都难以达到工业化水平。因此寻找和建立表达效率高、酶活性高的肝素酶重组表达技术、以及寻找新型的可以商业化的肝素酶I，具有重要的理论和现实意义。

发明内容

本发明意在提供埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白，以解决使用生物工程技术获得的肝素酶的酶活性有限的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白，包括肝素酶I和麦芽糖结合蛋白，肝素酶I和麦芽糖结合蛋白之间连接有连接肽，所述连接肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.11或者SEQ ID NO.12所示。

本方案的原理及优点是：肝素酶I大多以肝素黄杆菌来源的肝素酶I为研究对象，本方案以埃氏拟杆菌来源的肝素酶I为研究对象，拓宽了酶的来源。发明人从埃氏拟杆菌中克隆获得肝素酶I基因，并对其性质和表达条件进行了大量研究。与普通的肝素酶I基因不同，在使用埃氏拟杆菌来源的肝素酶I基因进行生物工程菌表达的时候，发明人发现表达的肝素酶I的活性有限，于是尝试了使用融合蛋白的方式来提升目的蛋白的活性。并通过大量研究和筛选发现，在制备肝素酶I和麦芽糖结合蛋白形成的融合蛋白时，需要在两个蛋白之间连接上核苷酸序列如SEQ ID NO.11或者SEQ ID NO.12所示的连接肽。由于上述两种连接肽的加入，保证由工程菌表达的融合蛋白可以正确折叠，并保证理想的酶活性。如果在肝素酶I和麦芽糖结合蛋白之间不加入连接肽，获得的融合蛋白的活性显著低于含有连接肽的融合蛋白的活性。如果将本方案的连接肽更换为其他种类的连接肽，获得的融合蛋白的活性也不及本方案制备获得的融合蛋白。由此可见，连接肽的选择对于本方案至关重要，使用核苷酸序列如SEQ ID NO.11或者SEQ ID NO.12所示的连接肽可以较为显著地增加融合蛋白的目的活性，减少包涵体肝素酶I的产生量，进而拓宽肝素酶I的来源，进而可以克服现有的肝素酶I的活性和产量都难以达到工业化水平的技术问题，具有重要的理论和现实意义。

进一步，埃氏拟杆菌肝素酶I融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.13或者SEQ IDNO.14所示。由肝素酶I、连接肽和麦芽糖结合蛋白融合形成的蛋白质序列为SEQ ID NO.13或者SEQ ID NO.14。上述蛋白具有较高的原核表达量和活性，适应于工业化应用和大规模生产。