[发明专利]治疗性多价HPV mRNA疫苗及其制备方法

说明书

本发明涉及生物制药技术领域，尤其是涉及治疗性多价HPV mRNA疫苗及其制备方法。本发明提供的mRNA分子利用核糖体跳跃元件对E6和E7基因进行连接能够同时表达HPV的E6和E7双抗原。将其与mRNA疫苗其他元件组合得到的治疗性mRNA分子经脂质纳米颗粒包封后，能够在体内和体外同时成功表达HPV的E6和E7双抗原。经过实验验证，本发明提供的mRNA疫苗能够有效同时表达双抗原蛋白E6和E7，并且通过LNP包封制备成mRNA疫苗免疫小鼠后，可以诱导产生较高的血清抗体水平，同时激发机体发生TH1和TH2型细胞免疫应答反应。

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，尤其是涉及治疗性多价HPV mRNA疫苗及其制备方法。

背景技术

人类乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)感染是宫颈上皮内瘤变及宫颈癌发生的主要因素，近年来，我国宫颈癌患病率和死亡率逐步上升，并且趋向年轻化。我国现有宫颈癌患者约四十万人，死亡率达11.30％，远高于发达国家5％的死亡概率。其中，50％的宫颈癌与HPV 16感染相关。在我国主要是HPV 16，18，52和58型感染。针对HPV感染引起的宫颈癌，目前有多种疫苗(2阶、4阶、9阶)上市，然后这些疫苗都是预防性疫苗(RenjieWang,Wei Pan,et al.(2020).Human papillomavirus vaccine against cervicalcancer:Opportunity and challenge)。如果人体已经感染HPV，现有疫苗不能阻止潜在的病变或肿瘤发展，因此研发治疗性HPV疫苗是目前HPV研究领域的重点。

细胞介导的免疫反应而不是体液免疫对于清除HPV感染和杀伤肿瘤细胞很重要。研究表明，HPV感染的自发清除和HPV持续感染与机体强的细胞介导的免疫反应有关，主要涉及TH1型细胞和分别来自CD4+和CD8+T细胞诱导产生细胞毒性T淋巴细胞(GemmaHancock,Karin Hellner et al.,(2017).Therapeutic HPV vaccines)。目前HPV治疗性疫苗研究主要包括多肽疫苗、蛋白质疫苗、病毒载体疫苗、DNA疫苗等(Andrew Yang,EmilyFarmer,T.C.Wu et al.(2016).Perspectives for therapeutic HPV vaccinedevelopment)。多肽疫苗是将预测的抗原表位通过化学技术进行合成，直接注射体内以引起抗肿瘤细胞反应。多肽疫苗耐受性、稳定性较好并且易于大规模生产，但是多肽疫苗在不同个体具有MHC-I类限制性，不一定对所有接种过疫苗的人有效。此外，多肽疫苗往往免疫原性较低，并且必须配合其他免疫调节剂一起使用，例如Toll样受体(TLR)激动剂，细胞因子和共刺激分子等。蛋白质疫苗具有免疫表位，规避了MHC-I类分子限制性问题，但是主要诱导体液免疫应答而非细胞免疫，每次免疫需要较高的剂量并且需要伴随着佐剂使用，免疫效果较弱。病毒载体疫苗研究的较为详细，它可以诱导良好的细胞免疫和体液免疫效果，并且免疫剂量较小，如图1所示，其中LITR/RITR为左/右反向末端重复序列，ES为包装信号序列，CMV为启动子序列，CRT为钙网蛋白的编码序列，E7为E7蛋白编码序列，(Jorge G,Gomez-Gutierrez et al.,(2007),Vaccination with an adenoviral vectorexpressing calreticulin-human papillomavirus 16 E7 fusion protein eradicatesE7 expressing established tumors in mice)。

但是，针对病毒载体疫苗预存的免疫反应仍是目前需要克服的困难，另外病毒基因有整合宿主基因组的风险。DNA疫苗具有生产简易、成本低，易于保存、不会引起载体免疫反应等优点，可以通过优化载体基因、DNA结构和共表达免疫刺激分子等方式产生更好的抗肿瘤细胞效果和中和反应。由于其复杂的免疫方式(如电穿孔、基因枪)常导致免疫接种困难、免疫效力不足，并且DNA疫苗还存在整合宿主基因组的风险，因此目前较难应用和推广(Ken Lin,Barbara Ma et al.,(2010),Therapeutic HPV DNA vaccines)。