[发明专利]一种猪冷冻精液解冻剂及其制备方法

说明书

本发明公开了一种猪冷冻精液解冻剂及其制备方法，属于猪冷冻精液解冻技术领域。本发明公开的一种猪冷冻精液解冻剂，组分为葡萄糖、果糖、柠檬酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、Tris‑HCl、HEPES、咖啡因、精浆和/或NMN。本发明的猪冷冻精液解冻剂可有效复苏猪冷冻精液、保证解冻和稀释后精子体外存活状况、保证精子理化性质指标正常、保证精子受精能力。

技术领域

本发明涉及猪冷冻精液解冻技术领域，更具体的说是涉及一种猪冷冻精液解冻剂及其制备方法。

背景技术

猪精液冷冻保存技术在猪种质资源保护和生猪繁殖生产中有良好的应用价值，但猪冷冻精液存在解冻后精子活力低、精子理化性质改变、人工授精效率低等问题，因此猪冷冻精液在国内外使用率较低。国内外针对猪冷冻精液解冻这一问题进行了一系列研究，但解冻和稀释过程中使用的解冻液种类较多，不同解冻液效果不一、存在解冻后精子复苏效果差，理化性质改变，如质膜受损、顶体受损、线粒体活性降低、受精效果差等问题。造成这些问题的原因在于解冻液中能量底物、缓冲物质、精子复苏物质之间配伍不合理，无法提供精子最适的生存条件。

为进一步改善猪冷冻精液解冻后精子活力、保证其理化性质、降低猪冷冻精液使用成本、提高猪冷冻精液使用效率，针对猪冷冻精液解冻配方进行研究十分重要，如何进行解冻配方之间各组分合理配伍，为精子冻融后提供合适的生存环境是本领域技术人员重要的研究方向之一。

因此，提供一种稳定高效的猪冷冻精液解冻剂及其制备方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种猪冷冻精液解冻剂及其制备方法，可有效复苏猪冷冻精液、保证解冻和稀释后精子体外存活状况、保证精子理化性质指标正常、保证精子受精能力。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种猪冷冻精液解冻剂，在解冻剂基础配方的基础上添加精浆和NMN，或者单独添加精浆或NMN；所述精浆的添加量为1.5％～5％(v/v)；所述NMN的添加量为0.083～0.250g/L；

所述解冻剂基础配方使用超纯水作为溶剂，1L解冻剂基础配方中各组分添加量为：葡萄糖15g、果糖10g、柠檬酸钠8g、碳酸氢钠3g、磷酸二氢钾1.42g、Tris-HCl 3.152g、HEPES 0.6g、咖啡因0.6g、青霉素钠20万IU、硫酸链霉素10万IU。

进一步，所述的一种猪冷冻精液解冻剂的制备方法，具体步骤如下：

(1)使用超纯水室温条件下添加葡萄糖、果糖、柠檬酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、Tris-HCl、HEPES、咖啡因、青霉素钠、硫酸链霉素，25℃磁力搅拌30分钟使各组分充分溶解，调pH值至6.8～7.2，渗透压至310～330mOsm/L，定容至1L；

(2)将步骤(1)获得的溶液使用0.22μm除菌滤器进行过滤；

(3)精浆和/或NMN在解冻猪冷冻精液前30分钟添加至步骤(2)过滤后的溶液中。

本发明的猪冷冻精液解冻剂配方按照步骤配制为解冻液后酸碱度pH(6.8～7.2)、渗透压(310～330mOsm/L)符合精子的最适生存条件。

本发明的猪冷冻精液解冻剂配方使用葡萄糖、果糖两种单糖为精子提供能量来源；

本发明的猪冷冻精液解冻剂配方使用柠檬酸钠、碳酸氢钠、Tris-HCl、HEPES作为解冻液缓冲物质，保证pH、渗透压；

本发明的猪冷冻精液解冻剂配方使用咖啡因作为精子复苏物质；

本发明的猪冷冻精液解冻剂配方使用精浆和/或NMN(β-烟酰胺单核苷酸)保证咖啡因诱导的精子复苏过程中精子理化性质正常；