[发明专利]三角帆蚌外套膜细胞的培养方法

说明书

本发明提供了一种三角帆蚌外套膜细胞的培养方法，培养方法通过添加外源生长因子和必须营养素、优化培养体系，及优化组织游离细胞获取程序，通过光学显微镜观测及细胞周期检测，结合传代细胞种属的COI基因分子鉴定，实现三角帆蚌外套膜组织细胞体外培养与传代。该发明包括三角帆蚌自体血清的获取和处理，组织的获取和处理，混合消化酶处理并收集游离细胞，细胞增殖培养基配制，及进行细胞原代及传代培养，能够提高细胞的存活能力和增殖活性，经过4‑5天的培养即可长满培养瓶，从而有效缩短培养时间，实现细胞传代培养；本发明的细胞增殖培养基配方简单，而且相比现有的培养基，可以有效降低杂菌污染的概率，更有效维持外套膜细胞的增殖能力。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种三角帆蚌外套膜细胞的培养方法。

背景技术

细胞培养技术广泛应用于染色体分析、细胞代谢、癌变机制、病毒的分离和鉴定以及药物筛选等研究领域(薛庆善.体外培养的原理与技术[M].科学出版社,2000,pp:16-23)。如果能够建立贝类的细胞系，必将为深入研究贝类病害机理，实现人工育珠的人工控制等方面提供极大便利。但到目前为止，在水生的无脊椎动物的细胞培养中，也仅建立了一种淡水蜗牛担轮幼虫胚胎(Biomphalaria glabrata embryonic,BGE)细胞系。而在贝类的细胞培养中还尚未建立起成功的细胞系。这仍然是当前国际上的攻关课题。

贝类的外套膜组织不仅作为贝类的保护性器官，而且具有分泌有机基质、形成碳酸钙结晶的功能，是形成贝壳和珍珠最重要的组织(李云娟，盛军庆，王军花等.池蝶蚌外套膜的组织学观察[J].南昌大学学报(理科版),2009,33(03):279-284.)，因此外套膜细胞的培养对水生贝类具有重要意义。但贝类外套膜组织属于高度分化的器官，在体外游离培养过程中分裂增殖能力较弱，会出现细胞不贴壁不增殖，同时培养过程中极易沾染细菌微生物等影响细胞生长的生物。因此，若要深入进行贝类病害机理、人工育珠、基因功能分析等研究，有必要对三角帆蚌外套膜细胞的培养方法和培养基进行改进，以延长细胞培养时间，提高细胞增殖活力，甚至建立起细胞系。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种三角帆蚌外套膜细胞的培养方法。即通过对组织的充分消毒处理，减少细菌和微生物的污染，从而采用胰蛋白酶对组织块进行消化，将消化后细胞接种到培养瓶中，加入细胞增殖培养基中进行原代和传代培养。

为达到上述目的，本发明的解决方案是：

一种三角帆蚌外套膜细胞的培养方法，其包括如下步骤：

(1)、自体血清的获取和处理：使用无菌的1mL注射器从三角帆蚌血窦部位抽取非抗凝淋巴血，置于15mL无菌离心管中离心，先使用0.45μm滤膜过滤两次上清液，后56℃孵育30min，最后使用0.22μm滤膜过滤两次，封口放置-20℃冰箱储存，得到三角帆蚌自体血清；

(2)、组织的获取和处理：使用75％酒精喷洒其表面，对外壳进行杀菌处理，时间为20min左右，开壳后用棉球擦拭两侧三角帆蚌壳的外套膜部位，并用灭菌的滤纸去除外套膜表面粘液，然后放置在预冷的PBS缓冲液中暂时保存；PBS缓冲液清洗3-5遍，75％酒精溶液清洗10s，依次用2％、10％、20％、10％、2％的梯度三抗清洗外套膜组织，最后将清洗的外套膜组织置PBS缓冲液中进行涮洗；

(3)、剪碎处理：使用无菌剪刀将外套膜组织剪至1mm左右大小，剪碎后加入两倍体积的0.25％胰蛋白酶和0.1％胶原蛋白酶混合液(美国Gibco)进行消化；

(4)、组织消化：4-6℃低温过夜消化外套膜组织8-15h，然后在35-38℃条件下继续消化20-25min，最后加入完全培养基终止反应，其中，完全培养基包含：10％三角帆蚌自体血清和RPMI-1640培养基；

(5)、收集细胞：分别用200目、400目细胞筛对消化后的细胞悬液过滤到无菌离心管中，收集细胞悬液，离心，弃上清，收集细胞沉淀；