[发明专利]三角帆蚌外套膜细胞的培养方法

权利要求书

1.一种三角帆蚌外套膜细胞的培养方法，其特征在于：其包括如下步骤：

(1)、从三角帆蚌血窦部位抽取非抗凝淋巴血，离心，经无菌滤膜过滤及温度处理，后封口放置-20℃储存，得到三角帆蚌自体血清；

(2)、对三角帆蚌外壳进行杀菌处理，开壳后擦拭两侧三角帆蚌壳的外套膜部位，并用灭菌的滤纸去除外套膜表面粘液，然后放置在预冷的PBS缓冲液中暂时保存；接着用PBS缓冲液和酒精溶液清洗，依次用不同浓度梯度的三抗清洗外套膜组织，最后将清洗的外套膜组织进行涮洗；

(3)、将三角帆蚌外套膜组织剪碎，然后加入两倍体积的胰蛋白酶与胶原蛋白酶混合液进行消化；

(4)、低温过夜消化外套膜组织，然后继续消化，最后加入完全培养基终止反应，其中，完全培养基包含：10％三角帆蚌自体血清和RPMI-1640培养基；

(5)、将消化后的悬液反复轻柔吹散，依次使用200目和400目细胞筛过滤，无菌离心管收集细胞悬液，离心后弃上清，收集细胞沉淀；

(6)、在无菌室进行细胞增殖培养基配制，其中细胞增殖培养基包含：RPMI-1640培养基、10％三角帆蚌自体血清、2％三抗、1％丙酮酸钠、1％非必需氨基酸、2ng/mL表皮生长因子、15ng/mL碱性成纤维生长因子、1ng/mL胰岛素样生长因子-1和0.1％2-巯基乙醇；

(7)、将步骤(5)离心收集的细胞沉淀用细胞增殖培养基分散并孵育，然后接种到细胞培养瓶中进行细胞培养；

(8)、当三角帆蚌外套膜细胞增殖到培养瓶底80％密度，消化，传代培养继续扩增。

2.根据权利要求1所述的三角帆蚌外套膜细胞的培养方法，其特征在于：步骤(1)中，所述离心的转速为1000-1500rpm，离心的温度为4℃，离心的时间为10-15min。

3.根据权利要求1所述的三角帆蚌外套膜细胞的培养方法，其特征在于：步骤(1)中，所述无菌滤膜过滤及温度处理的过程为：采用0.45μm滤膜过滤上清液；采用56℃孵育血清30min，并采用0.22μm滤膜过滤。

4.根据权利要求1所述的三角帆蚌外套膜细胞的培养方法，其特征在于：步骤(2)中，所述三抗的浓度梯度为2％、10％、20％、10％、2％，每个浓度梯度的清洗时间为1-3min。

5.根据权利要求1所述的三角帆蚌外套膜细胞的培养方法，其特征在于：步骤(3)中，所述胰蛋白酶的含量为0.25％，所述胶原蛋白酶的含量为0.1％。

6.根据权利要求1所述的三角帆蚌外套膜细胞的培养方法，其特征在于：步骤(4)中，所述低温过夜消化的温度为4-6℃，时间为8-15h。

7.根据权利要求1所述的三角帆蚌外套膜细胞的培养方法，其特征在于：步骤(4)中，所述继续消化的温度为35-38℃，时间为20-25min；所述终止的时间为8-15min。

8.根据权利要求1所述的三角帆蚌外套膜细胞的培养方法，其特征在于：步骤(5)中，所述离心的转速为1000-1500rpm，离心的时间为8-10min。

9.根据权利要求1所述的三角帆蚌外套膜细胞的培养方法，其特征在于：步骤(6)中，所述非必需氨基酸包括L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-天门冬酰胺、L-天门冬氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸和甘氨酸。

10.根据权利要求1所述的三角帆蚌外套膜细胞的培养方法，其特征在于：步骤(7)和步骤(8)中，所述培养的过程为：加入细胞增殖培养基，每隔24h半数换液。