[发明专利]MALDI-TOF MS及其飞行时间校准方法

说明书

本发明公开了一种MALDI‑TOF MS及其飞行时间校准方法，其包括：根据实际检测谱图与理论飞行时间图谱谱峰的位置构造空间向量；构造动态变化的飞行时间差Δt，将实际检测谱图中的空间向量中各分量向前或向后移动飞行时间差Δt形成新的修正向量，利用余弦相似性算法对修正向量和理论飞行时间图谱的理论空间向量进行相似性比较，得到相似性最高的Δt_最优，再将实际检测谱图质谱峰整体向左或向右平移Δt_最优。修正了样品因结晶差异或样品靶和移动平台平整度引起的飞行时间漂移，提高了仪器的质量精度。并且无需像内标法一样加入内标物，不对样品的检测造成影响，使用样品的全峰信息，相对只使用几个峰的校准算法具有更佳校正效果。

技术领域

本发明涉及生物软电离质谱技术领域，具体而言，涉及一种MALDI-TOF MS及其飞行时间校准方法。

背景技术

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF MS）是近年来发展起来的一种新型的生物软电离质谱技术，具有样品处理简单、检测通量高、快速准确、灵敏度高等优点，现已成为多肽、蛋白质、核酸等生物大分子检测的有效工具。利用双脱氧核苷酸3’端复制终止特性的单碱基延伸技术搭载MALDI-TOF MS而建立的核酸质谱检测系统将高精确度的质谱技术与计算机智能分析功能结合，成为了单核苷酸多态性（SNP）、基因突变、DNA甲基化等分子检测的重要工具。

核酸质谱检测具体检测过程如下：利用自动点样装置将经多重PCR扩增和单碱基延伸技术前处理的样品转移至样品靶上，待样品与基质在样品靶上自然风干形成共结晶体。然后将样品靶放入仪器中等待检测，在检测软件中创建谱图采集任务，导入包含样品中延伸引物和延伸产物分子量的Assay文件，开始采集任务。样品与3-HPA基质在靶板形成共结晶薄膜，通过激光照射共结晶体使得样品离子化，产生不同质荷比的离子，然后再经过质量分析器测定该样品中不同种类离子的分子量，并在3000-10000 Da质量范围内按照从小到大的顺序依次排列从而得到一幅质量图谱。分型分析软件根据导入的Assay文件各样品序列的分子量信息进行分型判读。

在核酸质谱检测系统中，仪器分辨率和质量精度对谱图质量影响最大，其直接影响软件的判型结果，进而导致假阳性或假阴性的诊断结果。特别地，MALDI-TOF的最终谱图由叠加而成，若单张谱图质谱峰存在一定偏差，经累加，最终谱图的质量精度可能会大幅度下降。由于MALDI-TOF MS通过激光轰击样品和基质在靶板上形成的共结晶的方式进行电离，激光轰击共结晶后使离子产生位置分散，在这种情况下，若共结晶分布不均匀，必将导致离子位置分散更大，通过仪器检测参数的调整，可以在一定程度上减少样品结晶不均匀带来的分辨率和质量精度影响，但无法完全消除。此外，共结晶体具有一定高度，激光连续轰击结晶点，表面的样品离子与结晶内部离子的高度差也会进一步降低质量精度。

除结晶形貌带来的影响外，靶托、靶板以及仪器X-Y移动平台加工精密度不够也同样是谱图质量精度低的重要原因。核酸质谱的靶板通过磁铁紧贴在靶托上，靶板与靶托的贴合程度、靶板表面平整度、靶托的平整度均是质量精度不佳的影响因素。靶托和靶板的形变会改变离子引出场的距离，导致离子飞行路径发生变化，造成同种离子的飞行时间差异，进而使谱图离子峰产生质量漂移，降低相应质荷比的质量精度。

为解决以上两种因素带来的质量精度问题，目前主要通过样品制备和靶板改良，来改善样品与基质的共结晶体的均匀性而提高质量精度。而共结晶均匀性受多重因素的影响，如基质选择、靶板材料以及表面处理技术、结晶干燥条件（真空/室温/通风/加热）等。例如，Chao-Jung Chen等人通过在靶板表面覆盖一层聚二甲基硅氧烷疏水层，缩小了样品点的面积，使分析物结晶均匀性得到了一定提升，同时增强了分析物的质谱信号。而对于靶板形变带来的质量精度影响，不锈钢靶板的可重复使用特性，增加了靶板产生不规则形变的可能性，而硅基芯片靶板由标准晶圆片制成，其表面平整度小于1μm，同时硅基芯片靶板为一次性耗材，避免了多次使用而导致磨损形变的问题，这在一定程度上保证了质量精度。虽然更换靶板改善了质量精度，但仍无法解决加工工艺不佳所致的样品靶或X-Y移动平台形变。