[发明专利]一种快速获取白参菌PCR产物的方法

说明书

一种快速获取白参菌PCR产物的方法，以白参菌的子实体作为原料，在冰浴下研磨预处理制备子实体上清液，采用2xT5 Direct PCR Mix(Plant)试剂盒对子实体上清液进行PCR反应，所述PCR反应具体是先进行预变性、然后进入变性、退火和延伸的循环中，循环结束后进行终延伸，循环中退火温度控制为56℃，退火时间为10s。本发明通过采用特定的白参菌子实体作为原料，再以特定的2xT5 Direct PCR Mix(Plant)试剂盒进行质扩获取PCR产物，方法较现有技术简单、高效，获取白参菌PCR产物的纯度和浓度高，ITS鉴定时间缩短一半，为后续分子鉴定工作、基因检测、寻找特异性片段等工作提高了准确性和高效性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速获取白参菌PCR产物的方法。

背景技术

基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段，如何获得DNA片段就成为基因工程的关键问题。所需目的基因的来源不外乎分离自然存在的基因或人工合成基因。常用的方法有PCR法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库法。PCR技术是聚合酶的链式反应，是一种在体外扩增特定基因或DNA序列的方法，只要直接目的基因的核苷酸序列，就可以利用PCR技术，将该片段扩增至数十万倍，乃至数千万倍。PCR技术不仅可以用来扩增、分离和筛选目标基因，而且在临床医疗诊断、基因突变与检测、分子进化研究等诸多领域有着重要用途。传统的PCR反应中，需要将DNA序列作为PCR底物，这导致在PCR扩增反应之前，需要进行DNA的提取，步骤繁琐、耗时较长。

针对白参菌(裂褶菌)的PCR产物提取，现有技术中是以白参菌的菌丝作为原料，需要进行DNA的提取，然后采用PCR试剂盒对DNA进行PCR扩增反应，但是获得的PCR产物中含有苹果酸、蛋白质、多糖等物质，使其纯度较低，且提取的浓度较低，造成后续无法继续使用。

发明内容

本发明目的在于提供一种快速获取白参菌PCR产物的方法。无需提取DNA就可以获得高纯度、高浓度的PCR产物。

本发明目的通过如下技术方案实现：

一种快速获取白参菌PCR产物的方法，其特征在于：在冰浴下研磨预处理制备子实体上清液，采用2xT5 Direct PCR Mix(Plant)试剂盒对子实体上清液进行PCR反应，所述PCR反应具体是先进行预变性、然后进入变性、退火和延伸的循环中，循环结束后进行终延伸，循环中退火温度控制为56℃，退火时间为10s，，循环次数为42-45次。

2xT5 Direct PCR Mix(Plant)试剂盒为市售产品，是一种无须提取DNA，可以直接进行PCR反应的试剂盒，但是该试剂盒主要适用于叶片、种子等为原料的植物，而应用于白参菌中未见报道，白参菌获取PCR产物往往采用其菌丝体作为原料进行PCR反应，在研究过程中发现，该试剂盒直接用于白参菌扩增，无法获得PCR产物。

本发明中以白参菌子实体为原料，同时通过针对白参菌子实体调整试剂盒对于的适宜反应条件，从而获得高纯度、高浓度的PCR产物。而该路线以白参菌菌丝体为原料直扩时，获得PCR产物杂质较多，纯度低。

进一步，上述PCR反应中的预变性具体是在98℃下变性3min，循环结束后在72℃下延伸3-5min。

进一步，上述循环过程中变性温度为98℃，时间为10s，退火温度控制为56℃，退火时间为10s，延伸温度为72℃、时间为20-30s。

进一步，上述白参菌子实体研磨预处理的冰浴温度为-20℃，研磨时间为2min，研磨结束后，取1研磨后的白参菌子实体浸于ddH₂O中，上下颠倒混匀后，简短离心，研磨后的白参菌子实体与ddH₂O的质量体积比为1mg：5uL。