[发明专利]一种改进的引导编辑系统及其应用

说明书

本发明涉及基因组编辑领域，具体涉及一种改进的引导编辑系统及其应用。所述引导编辑系统包括pegRNA和融合蛋白，所述融合蛋白由nCas9(H840A)和M‑MLV组成，其中，nCas9(H840A)的N端连接有T5核酸外切酶或Pol‑N核酸外切酶；所述pegRNA依次由sgRNA和PBR+RT序列组成。本发明的引导编辑系统编辑效率在现有技术的基础上进一步提高，极大的促进了引导编辑系统的发展和应用。

技术领域

本发明涉及基因组编辑领域，具体涉及一种改进的引导编辑系统及其应用。

背景技术

成簇规律间隔短的回文重复序列及其相关系统(Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats associated protein，CRISPR/Cas)由于其简便、快捷、高效等特点，几乎取代所有的基因组编辑技术，被广泛应用在动植物研究中。CRISPR/Cas9系统主要是由Cas9核酸内切酶蛋白和单链引导RNA (single guide RNA，sgRNA)构成，Cas9蛋白在sgRNA的引导下，识别特定的靶点，在前间区临近基序(Protospacer adjacent motif，PAM)后切割产生DNA 双链断裂(DNA double-strandbreak，DSB)，引发机体的自我修复机制，实现 DNA定点突变。细胞中常见的DSBs修复途径是非同源末端连接 (Non-homologous end-joining，NHEJ)和同源重组(Homologousrecombination， HR)。HR是一种精确的修复途径，需要供体模板的参与，可实现精确的基因定点突变。但是HR通常载体设计复杂，主要发生在细胞分裂的G2期和S期，受编辑时期的限制，且编辑效率较低，难以广泛应用。NHEJ是一种易错修复途径，通常只能引入小范围碱基的随机插入/缺失(insertion and deletion，indels)，且突变类型多样难以控制。由CRISPR/Cas系统衍生的基因组编辑技术包括碱基编辑器(base editing，BE)和引导编辑器(prime editing，PE)。

常规的BE包括胞嘧啶碱基编辑器(CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，主要由胞嘧啶脱氨酶/腺嘌呤脱氨酶、nCas9(nickase Cas9)和sgRNA构成。在sgRNA的引导下，nCas9和脱氨酶融合蛋白结合靶点，对特定的碱基进行脱氨，进而通过DNA损伤修复产生碱基定点替换。胞嘧啶脱氨酶识别脱氨胞嘧啶(C)，形成尿嘧啶(U)，进而通过DNA复制或修复将U转变为T，最终实现C-G到A-T碱基对的替换。使用最广的胞嘧啶脱氨酶为大鼠源性胞苷脱氨酶(rAPOBEC1)。腺嘌呤脱氨酶识别腺嘌呤(A)，脱氨形成肌苷(I)，由于I的化学结构与G类似，在DNA修复过程中被错误的识别为G，修复互补链中的 T为C，进而实现A-T到G-C的转换。常用的腺嘌呤脱氨酶为优化的大肠杆菌 tRNA腺嘌呤脱氨酶(ecTadA*)和野生型ecTadA构成的异源二聚体。BE可以实现目标位点精准单碱基突变，但是目前两种碱基编辑器只能实现C-T和A-G 的转换，不能实现颠换，且易受编辑窗口的限制，编辑类型及范围有限。全基因组测序发现，BE也会引起一定程度的脱靶突变。