[发明专利]一种真皮微血管周细胞的纯化、鉴定方法及纯化得到的细胞

说明书

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种真皮微血管周细胞的纯化、鉴定方法及纯化得到的细胞。纯化方法包括：取皮肤组织，修剪保留真皮组织；将修剪后的皮肤组织采用中性蛋白酶水解，分离表皮和真皮；将真皮使用胶原酶消化；过滤，收获细胞悬液，离心，使用周细胞培养基培养细胞；当培养皿中细胞密度达80％～90％，弃去周细胞培养基，洗涤，吹打培养皿，得到细胞悬液，离心，保留细胞沉淀，用周细胞培养基重悬细胞，再次接种到培养皿中；重复纯化一次，获得真皮微血管周细胞。本发明提出了一种分离效果好、操作简单的真皮微血管周细胞的纯化方法，本方法可以提供数量充足、来源可靠、质量稳定的真皮微血管周细胞。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种真皮微血管周细胞的纯化、鉴定方法及纯化得到的细胞。

背景技术

在过去几十年间我们对真皮微血管有了更加广泛和深入的认识。尽管对真皮微血管的结构和功能有了实质性的进展，但包括增生性瘢痕、瘢痕疙瘩、皮瓣缺氧再灌注损伤、银屑病等真皮微血管异常疾病依然是世界性难题。研究发现在增生性瘢痕、瘢痕疙瘩等真皮微血管异常疾病中均存在不同程度的缺氧，而血管对氧气的运输至关重要。因此矫正真皮微血管异常显得尤为重要。

真皮微血管的形成，包括内皮细胞的增殖和迁移，血管基底膜的发展，以及随后包括周细胞在内的支持细胞的募集。周细胞在稳定血管壁、控制血管扩张、调节血流灌注等方面起着重要的调节作用。然而目前在真皮微血管异常疾病如增生性瘢痕、瘢痕疙瘩、皮瓣移植等，周细胞的作用极少被提及。

研究发现肺、心脏、视网膜、肾等组织的微血管出现异常后，微血管周细胞的数量和功能改变，并与内皮细胞分离从微血管中脱落，而且新生血管周细胞的覆盖率低，导致血管完整性受损。在皮瓣缺氧再灌注损伤动物实验中也发现，缺氧再灌注损伤导致真皮微血管周细胞受损，表现为数量减少、从微血管脱落。另一方面，在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中发现，大多数新生微血管存在不同程度的血管渗漏，说明周细胞与内皮细胞比例存在异常。因此更应重视周细胞在真皮微血管异常疾病中的作用。

因此，研究周细胞对真皮微血管的调控，可为今后研究真皮微血管异常疾病创造有利条件。为解决以上的科学及临床问题，亟需一种真皮微血管周细胞的纯化及鉴定方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种真皮微血管周细胞的纯化、鉴定方法及纯化得到的细胞。

本发明提供了一种真皮微血管周细胞的纯化方法，至少包括以下步骤：

S1、取皮肤组织，修剪保留真皮组织；

S2、将修剪后的皮肤组织采用中性蛋白酶水解，分离表皮和真皮；

S3、将真皮使用胶原酶消化；

S4、将消化后的真皮过滤，收获细胞悬液，将细胞悬液离心后，使用周细胞培养基培养细胞；

S5、当培养皿中细胞密度达80％～90％，弃去周细胞培养基，使用PBS洗涤细胞2～3次，最后一次洗涤后细胞中保留PBS，吹打培养皿20～40次，吹打的频率为每2～5秒一次，得到细胞悬液，离心，保留细胞沉淀，用周细胞培养基重悬细胞，再次接种到培养皿中；

S6、重复S5，获得真皮微血管周细胞。

可选的，在S2中，中性蛋白酶水解的条件为在0～5℃条件下孵育8～16小时；中性蛋白酶溶液的浓度为2mg/mL。

可选的，在S3中，胶原酶的浓度为1.25mg/mL，消化的条件为35℃～38℃，时间为30～50分钟；消化过程中，每间隔8～12分钟将容器上下倒置5～10次。

可选的，在S4中，先加入周细胞培养基终止消化，然后将消化后得到的真皮瓣组织以及消化液于70μm的滤器中过滤，冲洗，获得细胞悬液；周细胞培养基与胶原酶的体积比为1：0.5～1。