[发明专利]一种真皮微血管周细胞的纯化、鉴定方法及纯化得到的细胞

权利要求书

1.一种真皮微血管周细胞的纯化方法，其特征在于，至少包括以下步骤：

S1、取皮肤组织，修剪保留真皮组织；

S2、将修剪后的皮肤组织采用中性蛋白酶水解，分离表皮和真皮；

S3、将真皮使用胶原酶消化；

S4、将消化后的真皮过滤，收获细胞悬液，将细胞悬液离心后，使用周细胞培养基培养细胞；

S5、当培养皿中细胞密度达80％～90％，弃去周细胞培养基，使用PBS洗涤细胞2～3次，最后一次洗涤后细胞中保留PBS，吹打培养皿20～40次，吹打的频率为每2～5秒一次，得到细胞悬液，离心，保留细胞沉淀，用周细胞培养基重悬细胞，再次接种到培养皿中；

S6、重复S5，获得真皮微血管周细胞。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在S2中，所述中性蛋白酶水解的条件为在0～5℃条件下孵育8～16小时；所述中性蛋白酶溶液的浓度为2mg/mL。

3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在S3中，所述胶原酶的浓度为1.25mg/mL，所述消化的条件为35℃～38℃，时间为30～50分钟；消化过程中，每间隔8～12分钟将容器上下倒置5～10次。

4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在S4中，先加入周细胞培养基终止消化，然后将消化后得到的真皮瓣组织以及消化液于70μm的滤器中过滤，冲洗，获得细胞悬液；

所述周细胞培养基与所述胶原酶的体积比为1：0.5～1。

5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在S4中，所述离心的条件为：时间为4～6min，速率800～1200r/min；离心后弃去上清液，保留细胞沉淀，使用周细胞培养基重悬细胞，继续培养；将培养皿置于细胞培养箱内孵育，间隔2～3天换液。

6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在S5中，所述离心的条件为：时间为4～6min，速率800～1200r/min；

使用PBS洗涤细胞时，采用八字法摇晃细胞5～10次为洗涤一次，摇晃的频率为每3～5秒晃动一次；

使用移液枪吹打培养皿，按压移液枪的速度以不产生气泡为准。

7.根据权利要求1、4或5所述的纯化方法，其特征在于，所述周细胞培养基的组成为：500mL基础培养基、8～12mL胎牛血清、4～6mL周细胞生长因子和4～6mL青霉素或链霉素；青霉素的浓度为10,000U/mL，链霉素的浓度为10,000μg/mL。

8.一种采用如权利要求1～7任一项所述的纯化方法所获得的真皮微血管周细胞。

9.一种真皮微血管周细胞的鉴定方法，其特征在于，采用免疫荧光法和/或蛋白免疫印迹法进行鉴定，

培养所述如权利要求8所述真皮微血管周细胞，采用α-SMA、PDGFR-β和CD31一抗对多聚甲醛固定后的细胞进行孵育，加入二抗孵育后采集信号；

培养所述如权利要求8所述真皮微血管周细胞，采用α-SMA、PDGFR-β和CD31一抗与转移后的蛋白进行孵育后，采用荧光标记二抗孵育后采集信号；

免疫荧光法结果中α-SMA染色为阳性、PDGFR-β染色为阳性、CD31为阴性时，鉴定为真皮微血管周细胞；

蛋白免疫印迹法结果中α-SMA和PDGFR-β表达、CD31不表达，鉴定为真皮微血管周细胞。

10.根据权利要求9所述的鉴定方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

所述免疫荧光法：培养所述真皮微血管周细胞，待细胞密度达80％～90％后，多聚甲醛固定，清洗，分别加入α-SMA、PDGFR-β、CD31一抗孵育，清洗，加入二抗后孵育，清洗，采集信号；

所述蛋白免疫印迹法：培养所述真皮微血管周细胞，待细胞密度达80％～90％后，收集细胞，使用BCA蛋白定量法进行蛋白定量，使用分离胶和浓缩胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳完毕后剥离胶并剪切下来，将蛋白转移到PVDF膜上；封闭，分别加入α-SMA、PDGFR-β和CD31一抗孵育，清洗；荧光标记二抗孵育，清洗，采集信号。