[发明专利]一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法

说明书

本发明涉及干细胞培养技术领域，且公开了一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法，包括以下步骤制备而成：称取体积份间充质干细胞无血清培养基100份、营养添加物10‑30份、非渗透性冷冻保护剂4‑10份、渗透性冷冻保护剂1‑3份，混合，过滤除菌，存储，得到人脐带间充质干细胞无血清冻存液，不含有动物血清和其它异源性蛋白，减少了人脐带间充质干细胞被污染的可能，不使用二甲基亚砜，避免了在临床上潜在的毒性风险，保持了人脐带间充质干细胞的生物特性和存活率，有效确保了细胞的分化能力，且操作简单，冻存效果好，可作为辅料直接使用，具有使用方便的特点。

技术领域

本发明涉及干细胞培养技术领域，具体为一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法。

背景技术

人脐带间充质干细胞是指从脐带中分离的一种多功能干细胞，来源于新生儿脐带中的华通氏胶，具有含量丰富、细胞纯净、免疫原性低的特点，且人脐带间充质干细胞是一种原始细胞，具有很强的分化能力，能分化成许多种组织细胞，同时取材容易、易收集和冷冻保存，具有广阔的临床应用前景和研究价值。

人脐带间充质干细胞在临床上已经广泛应用，但是受到冻存条件的限值，不能大规模的应用，细胞冻存是细胞长期保存的一种重要手段，细胞冻存液通过冷冻保护剂在冻存过程中对细胞进行保护，减少冷冻冰晶对细胞造成的损伤，现有技术中的细胞冻存多采用血清进行冻存，血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长所需要的营养成分、生长因子和微量元素，能够支持细胞的生长和增殖，同时含有的蛋白能够对细胞起到一定的保护作用，但血清中含有各种不明确的动物源性物质，成分复杂，差异性较大，会对细胞分化造成很大的干扰，还可能引起病原体的交叉感染，影响细胞生长，甚至导致细胞死亡，因此开发出无血清的人脐带间充质干细胞冻存液具有非常重要的研究价值和实际意义。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法，避免了含有血清的人脐带间充质干细胞冻存液在临床使用过程中可能存在的风险，解决了常规血清冻存液对细胞分化产生的干扰和病原体污染。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法，包括以下步骤制备而成：

步骤一、制备原料：按照体积份计，在生物安全柜中称取间充质干细胞无血清培养基100份、营养添加物10-30份、非渗透性冷冻保护剂4-10份、渗透性冷冻保护剂1-3份；

步骤二、混合：将步骤一中称取的原料依次加入到无菌试剂瓶中，在生物安全柜中，搅拌混合均匀，得到混合液；

步骤三、过滤除菌：将步骤二中的混合液通过0.2μm滤膜进行过滤除菌，转移到新的无菌试剂瓶中，并对无菌试剂瓶中的混合液进行微生物、支原体检测，为阴性合格后备用；

步骤四、存储：对步骤三中装有检测合格混合液的无菌试剂瓶进行密封处理，冷藏存储。

作为本发明进一步的方案：所述步骤一中非渗透性冷冻保护剂包括羟乙基淀粉、海藻糖、蔗糖、羧甲基纤维素钠中的一种或几种。

作为本发明进一步的方案：所述步骤一中渗透性冷冻保护剂包括甘油、乙二醇中的一种或两种。

作为本发明进一步的方案：所述步骤一中营养添加物包括氨基酸、维生素，其中氨基酸和维生素的体积比为10:2-5。

作为本发明进一步的方案：所述氨基酸包括缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、天门冬氨酸中的一种或几种。

作为本发明进一步的方案：所述维生素包括维生素C、维生素B6、维生素B12中的一种或几种。

作为本发明进一步的方案：所述冷藏存储的温度为2-8℃。

作为本发明进一步的方案：所述的人脐带间充质干细胞无血清冻存液在人脐带间充质干细胞冻存中的应用。