[发明专利]一种用于超微量核酸全自动提取的纳米硅羧基磁珠的制备方法及应用

说明书

本发明公开一种用于超微量核酸全自动提取的纳米硅羧基磁珠的制备方法及应用，是将磁性纳米Fe₃O₄颗粒的表面包裹一层高浓度的硅羟基再进行羧基化；制得的硅羧基磁珠为核壳结构，包括Fe₃O₄纳米颗粒内核，SiO₂和‑COOH外壳层，Fe₃O₄纳米颗粒外表面包覆多个SiO₂‑COOH外壳层；制得的硅羧基磁珠形状规则，分散性好，饱和磁化强度高，硅羧基磁珠粒径均一，对核酸的吸附性强，提取核酸纯度高，适用自动化。

技术领域

本发明属于磁珠技术领域和医学检验技术领域，特别是涉及一种用于超微量核酸全自动提取的纳米硅羧基磁珠的制备方法及应用。

背景技术

核酸包括脱氧核糖核酸 (RNA) 和核糖核酸 (DNA) 两类，是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一，核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内，生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白，不同的核酸其化学组成、核苷酸排列顺序等不同，为了能够更加仔细的研究核酸，需要对其进行提取，在生物医学的各个领域也离不开核酸的提取。目前，磁珠已被广泛应用于多个领域，磁珠法作为新的核酸提取方法，因其操作简单，不需要负压或反复离心，且易于自动化等优点受到了越来越广泛的应用。 磁珠本质是四氧化三铁（Fe₃O₄）包裹有机基团后在特殊的溶液中具有较强结合核酸的能力，有机硅羧基团在特定缓冲液中可以有效的结合核酸，在有磁场条件下，具有能够从溶液中将其分离出来的特性，利用这个特性能够将目的核酸从不同的样品中提取分离出来。磁珠在外磁场的作用下可以定向移动和集中，撤去外磁场后，又可以恢复原来的结构与状态，从而结合在DNA，杂质不会结合到磁珠上，将混合于复杂体系中的脱氧核糖核酸分离变得快捷简便。

但是由于现有磁珠大小不一，表面活性基团不足，核酸亲和力弱，其提取核酸收率和纯度不高，难以满足生物医学领域的需求，并且对生物样品的需求仍在上百毫克，故难以保证对珍贵或稀有的人体组织等样品的核酸的高效提取纯化。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的是提供一种用于超微量核酸全自动提取的纳米硅羧基磁珠的制备方法，其工艺流程简单，操作简便，原料成本低，适宜于工业化大批量生产；并且制得的磁珠结构与市面上现有的磁珠结构不同，大小更加均匀，可以大幅度提高核酸提取的效率，实现超微量提取核酸的技术方案；同时提供上述磁珠在多种来源的超微量核酸提取中的应用，通过简单的洗脱步骤去除杂质，得到高纯度DNA/RNA。

一种用于超微量核酸全自动提取的纳米硅羧基磁珠的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，超顺磁性甘油修饰的Fe₃O₄纳米颗粒的制备：配置0.5mol/L的可溶性三价铁离子盐加入到乙二醇溶液中，搅拌均匀后加入CH₃COONa·3H₂O至体系PH为中性，然后将该混合溶液倒入密闭容器中，在150～300℃条件下反应6～12h，冷却至室温后，磁分离出黑色沉淀，用去离子水反复洗涤沉淀物数次，-10℃冷冻干燥12h，得到超顺磁性甘油修饰的Fe₃O₄纳米颗粒；加入无水乙醇，得到纳米磁珠无水乙醇混合液；超声振荡纳米磁珠无水乙醇混合液25～35分钟后，加入硅烷化试剂，室温下搅拌6～8小时，磁分离，即得到硅基包被磁珠。

步骤二，制备Fe₃O₄-SiO₂-COOH纳米硅羧基磁珠：取上述步骤一中获得的的硅基包被磁珠2g及羟基丁二酸2g 于100 ml 的水溶液中90℃充分搅拌反应2小时，用双蒸水洗至PH中性,并真空干燥，获得Fe₃O₄/SiO₂-COOH纳米硅羧基磁珠。

进一步地，所述步骤一中加入的硅烷化试剂为APTES,SELECTRA-SIL试剂。