[发明专利]一种基于内源CRISPR-Cas系统的副干酪乳杆菌基因编辑系统及应用

说明书

本发明公开了一种基于内源CRISPR‑Cas系统的副干酪乳杆菌基因编辑系统，该基因编辑系统包括：通过在穿梭质粒载体pTRKH2上插入mini‑CRISPR阵列表达框，阵列表达框包括：启动子、带有两个Bsa1酶切位点的crRNA插入位点碱基序列、LpCas9SgRNAScaffold碱基序列和终止子。本发明还公开了基于内源CRISPR‑Cas系统的副干酪乳杆菌基因编辑系统的应用。本发明的打靶载体无Cas核酸酶，可极大缩减载体大小，更易转化进乳酸菌，没有细胞毒性，能敲除大于1.0kb的长片段，操作简单，周期较短。

技术领域

本发明属于基因工程和生物技术领域，具体涉及一种基于内源CRISPR-Cas系统的副干酪乳杆菌基因编辑系统及应用。

背景技术

越来越多的研究和临床实践证明乳酸菌及其菌剂具有良好的促进健康作用，在医药和健康领域具有广泛应用前景，但是乳酸菌相关菌株编辑研究开展缓慢，主要面临两个难题，一是乳酸菌菌株种类繁多，常规的乳酸菌筛选是一项耗时耗力的工作；二是随着越来越多乳酸菌基因组被测序，大量未知基因需要进行功能解析，传统的乳酸菌基因操作手段过程繁琐、效率低下，亟待开发快速高效的遗传操作工具。传统的乳酸菌基因操作手段多是基于基因同源重组原理开发的，比如基于染色体和质粒的同源重组方法即利用乳酸菌内源的同源重组系统、Red/RecET介导的双链DNA(dsDNA)重组即利用外源噬菌体辅助重组系统、单链DNA(ssDNA)重组和基于CRISPR-Cas系统的基因编辑等。

最广泛使用的是经典的基于质粒的同源双交换的方法，此方法利用含有抗性筛选标记和目的基因同源修复模板的整合质粒，借助宿主内源的RecA系统进行DNA交换，这种方法的阳性转化子的筛选耗时耗力，在有选择压力的条件下50％以上细胞会发生重组，为了提高筛选效率，通常会在同源修复模板之间插入抗性基因或引入反选择标记系统，这种方法耗时较长，做敲除需要至少18天；Red/RecET介导的双链DNA重组的方法则是一种更精确的基因编辑方法，已经成功应用于乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)等，可以帮助宿主克服重组效率低的问题，但是Red/RecET系统是噬菌体特有的重组酶系统，具有很强的物种特异性，只能在进化上相近的物种或噬菌体宿主中发挥作用，引入其他菌株时重组效率受到很大限制；在重组酶和含有目的突变位点的寡核苷酸帮助下，ssDNA重组可实现无标记定点突变，但是这种方法无法进行大片段插入或敲除，片段长度超过500bp效率极低。

近年来，以酿脓链球菌SpyCas9为核心的CRISPR-Cas9技术及其衍生技术已经发展成为基因组精准编辑工具，该技术在哺乳动物、植物等真核生物中应用较为广泛且成熟，但是在一些乳酸菌中的应用仍然受到多种因素限制。这种方法需要在菌株内导入一个带有SpyCas9、引导RNA(sgRNA)和同源修复模板的质粒系统，其中的sgRNA是一种可识别靶标DNA的crRNA-tracrRNA嵌合体，crRNA的5’端含有20bp-24bp可变序列，可精确地结合靶DNA，tracrRNA的3’端带有与Cas9结合的发夹结构。这种方法利用Cas9的两个核酸酶结构域，对特定核酸位点进行切割，使宿主基因组发生双链断裂(double strand break,DSB)，然后通过对断裂位点进行修复来引入基因突变，乳酸菌和大多数原核生物一样，菌体内通常缺乏非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)修复机制，需导入同源修复模板或借助外源修复途径(homologous recombination,HR)修复DSB，这通常导致构建的打靶质粒较大，而对于具有较厚细胞壁的乳酸菌来说，增加了打靶质粒导入宿主细胞的电转难度，另一方面，SpyCas9对部分乳酸菌有细胞毒性，异源Cas蛋白对乳酸菌基因组的切割过于剧烈，基因组双链断裂导致细胞死亡，这些都限制了SpyCas9在乳酸菌中的应用。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。