[发明专利]一种基于内源CRISPR-Cas系统的副干酪乳杆菌基因编辑系统及应用

权利要求书

1.一种基于内源CRISPR-Cas系统的副干酪乳杆菌基因编辑系统，其特征在于，包括：在穿梭质粒载体pTRKH2上插入mini-CRISPR阵列表达框，所述mini-CRISPR阵列表达框从5’到3’方向依次包括：启动子、带有两个Bsa1酶切位点的crRNA插入位点碱基序列、LpCas9SgRNA Scaffold碱基序列和终止子。

2.如权利要求1所述的基于内源CRISPR-Cas系统的副干酪乳杆菌基因编辑系统，其特征在于，所述带有两个Bsa1酶切位点的crRNA插入位点碱基序列来自靶标位点，为基因组上任意PAM序列的5’端上游紧邻的一段20bp的碱基序列。

3.如权利要求1所述的基于内源CRISPR-Cas系统的副干酪乳杆菌基因编辑系统，其特征在于，所述LpCas9 SgRNA Scaffold碱基序列如SEQ ID NO:2所示，所述启动子为副干酪乳杆菌源的乳酸脱氢酶启动子，其碱基序列如SEQ ID NO:3所示，所述终止子为非ρ因子依赖性终止子TTTTTT。

4.如权利要求1所述的基于内源CRISPR-Cas系统的副干酪乳杆菌基因编辑系统，其特征在于，所述穿梭质粒载体pTRKH2上还负载有氨苄青霉素基因序列和其启动子，碱基序列如SEQ ID NO:4所示。

5.如权利要求1所述的基于内源CRISPR-Cas系统的副干酪乳杆菌基因编辑系统，其特征在于，所述穿梭质粒载体pTRKH2上还负载有根据靶标位点的上下游分别设计的上游同源修复模板和下游同源修复模板。

6.基于内源CRISPR-Cas系统的副干酪乳杆菌基因编辑系统的应用，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、找出副干酪乳杆菌基因组上的靶标位点附近的PAM序列，选择PAM序列的5’端上游紧邻的一段20bp的碱基序列做SgRNA，

步骤二、将步骤一所述的SgRNA连接到如权利要求1所述的基因编辑系统的crRNA插入位点处，得到自我靶向质粒pTRST-Sg，

步骤三、根据靶标位点的上下游碱基序列设计同源修复模板，并将同源修复模板插入在所述自我靶向质粒上，得到靶标目的基因的打靶质粒pTRST-Sg-HR，

步骤四、将所述打靶质粒转化副干酪乳杆菌，并挑选出成功敲除靶标位点的菌落，完成对所述靶标的基因编辑。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤二中，还包括如下步骤：

将所述自我靶向质粒pTRST-Sg电转进副干酪乳杆菌，若转化效率显著下降则说明内源CRISPR/LpCas9系统有活性。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤三中，得到所述的打靶质粒pTRST-Sg-HR方法包括如下步骤：

a)线性化载体制备：利用BamHⅠ限制性内切酶酶切所述自我靶向质粒pTRST-Sg，将质粒线性化；

b)以野生型副干酪乳杆菌基因组为模板，在靶标位点上下游附近分别设计引物，通过PCR扩增得到长度为1.0kb的上游同源修复模板和长度为1.0kb的下游同源修复模板，

c)连接反应：利用无缝克隆试剂盒将所述上游同源修复模板和所述下游同源修复模板分别连接在a)中的线性化自我靶向质粒pTRST-Sg上，得到打靶质粒pTRST-Sg-HR。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤四中，以转化成功的副干酪乳杆菌的基因组为模板，在靶标位点的上游同源臂和下游同源臂上设计一对验证引物进行PCR扩增，若扩增产物长度符合突变条带理论长度，且测序结果中未检测到所述靶标位点的碱基序列，则得到所述阳性菌株。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述突变条带理论长度为野生型条带长度减去两个同源修复模板之间的长度，其中所述的野生型条带长度为：以野生型副干酪乳杆菌基因组为模板，以如权利要求9所述的验证引物为引物进行PCR扩增所得到的条带长度。