[发明专利]Herceptin联合4-1BBL体外扩增NK方法

说明书

本发明涉及体外扩增NK细胞的方法领域，尤其涉及Herceptin联合4‑1BBL体外扩增NK方法。本发明将外周血单个核细胞接种到预包被的赫赛汀和4‑1BBL蛋白的细胞培养瓶中，并添加含IL‑2、IL‑15、IL‑21和自体血浆的培养基。其中赫赛汀可以在体外活化NK并促进NK增殖。4‑1BBL蛋白作为配体与NK细胞表面的受体4‑1BB结合并活化，具有促进NK细胞增殖和IFN‑γ的分泌，增强CTL的杀伤活性和ADCC作用。上述技术可以快速活化增殖为纯度高的NK细胞。不需要磁珠或滋养层细胞活化，避免复杂的分选操作，不存在滋养细胞安全性问题及多因子造成的成本过高问题。

技术领域

本发明涉及体外扩增NK细胞的方法领域，尤其涉及Herceptin联合4-1BBL体外扩增NK方法。

背景技术

现有的体外扩增NK细胞技术中，细胞培养方法采用赫赛汀、Herceptin和PHA、RetroNectin+美罗华抗体+鼠抗人CD161抗体包板、透明质酸+CD16+

RetroNectin等等，还有经典的采用滋养细胞的方法。上述方法在操作过程中容易引入安全性问题(例如多种外源因子或试剂的引入均可能增加细胞质量控制的难度，进而增加临床应用的风险)，且存在操作复杂，导致工艺不稳定及成本较高的问题。

发明内容

针对背景技术中存在的问题，提出Herceptin联合4-1BBL体外扩增NK方法。本发明将外周血单个核细胞接种到预包被的赫赛汀和4-1BBL蛋白的细胞培养瓶中，并添加含IL-2、IL-15、IL-21和自体血浆的培养基。可以快速活化增殖为纯度高的NK细胞。不需要磁珠或滋养层细胞活化，避免复杂的分选操作，不存在滋养细胞安全性问题及多因子造成的成本过高问题。

本发明提出Herceptin联合4-1BBL体外扩增NK方法，方法步骤包括：

S1、从外周血中分离出单个核细胞；

S2、将外周血单个核细胞接种到预包被的赫赛汀和4-1BBL蛋白的细胞培养瓶中，并添加含IL-2、IL-15、IL-21和自体血浆的培养基；

S3、连续培养14-17天，获得高纯度高活性NK细胞。

优选的，培养前需要先包被Herceptin和4-1BBL。

优选的，包被液的组成成分包括10mlPBS、35ug Her-2和17ug 4-1BBL蛋白，混合制备。

优选的，具体步骤包括：

A、包被：将包被液加入培养瓶，铺平放匀，在4℃条件下，避光过夜；

B、采血：采集外周血15ml,将其加入离心管一中备用；

C、淋巴细胞分离液分离：向离心管中加入等体积PBS至30ml，混匀后转移至提前添加15ml淋巴分离液的离心管二，在1800rpm/800g，室温条件下离心20min，升降速设为0；

D、洗涤PBMC：用吸管将离心后中间白色的PBMC层吸出，在离心管三中加入18-22ml的PBS清洗，在2000rpm条件下离心6min，弃上清；再次用20mlPBS清洗，在1800rpm条件下离心6min，弃上清；使用培养基重悬、混匀、取样，采用typan blue染色计数，1800rpm条件下离心6min，弃上清；

E、配制细胞悬液：用40ml培养基重悬细胞、沉淀、混匀；

F、接种细胞：取40ml上述的细胞悬液加入培养瓶，添加终浓度30ng/ml的IL-15、终浓度100ng/ml的IL-21、终浓度5％的自体血浆、终浓度6000U/ml的IL-2，将接种后的培养瓶置二氧化碳培养箱培养；

G、培养至4、6、8、11和14天时分瓶培养，期间检测，并在第17日回收细胞。