[发明专利]胎盘间充质干细胞来源的胞外囊泡、制剂及其在制备抗卵巢早衰相关药物制剂中的应用

权利要求书

1.胎盘间充质干细胞的胞外囊泡，以WesternBlot方法检测结果计，所述胞外囊泡高表达CD63、CD81、CD44、CD29、CD105、VEGF和HGF蛋白；以RT-PCR检测计，所述胞外囊泡还高表达let-7d、let-7e和let-7g三种miRNA。

2.根据权利要求1所述的胞外囊泡，其特征在于，其平均径为264.3～389.0nm，PDI值为0.075～0.150。

3.权利要求1或2所述的胞外囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

获得分离的原代胎盘间充质干细胞；

将所述原代胎盘间充质干细胞进行传代培养，得到第2代胎盘间充质干细胞；

将所述第2代胎盘间充质干细胞进行依次传代培养，得到其第5代或第6代的胎盘间充质干细胞培养物；

收集所述第5代或第6代的胎盘间充质干细胞培养物，分离纯化以得到所述胞外囊泡；

其中，传代培养过程中使得了包含雌二醇苯甲酸酯、霉酚酸酯和10-O-(2-L-甘氨酰)-银杏内醋B盐酸盐中的至少一种添加物的DMEM/F12培养液进行培养。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，其中传代培养为将所述第2代胎盘间充质干细胞培养物作为种子依次进行传代，传代培养中使用了的培养基包括第3代培养液、第4代培养液和第5代培养液；

所述第3代培养液为包含0.1～0.25μM雌二醇苯甲酸酯的DMEM/F12培养液；所述第4代培养液为包含0.15～0.35μM雌二醇苯甲酸酯和0.5～2μM霉酚酸酯的DMEM/F12培养液；所述第5代培养液为包含0.15～0.3μM雌二醇苯甲酸酯、4.0～7.5μM霉酚酸酯和10～15μg/mL10-O-(2-L-甘氨酰)-银杏内醋B盐酸盐的DMEM/F12培养液。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，传代培养中使用了的培养基还包括第6代培养液，所述第6代培养液为包含0.15～0.35μM雌二醇苯甲酸酯、5.5～7.5μM霉酚酸酯和10～15μg/mL 10-O-(2-L-甘氨酰)-银杏内醋B盐酸盐的DMEM/F12培养液。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，得到第6代胎盘间充质干细胞培养物的步骤包括：

制得得到丝素蛋白纳米纤维非织造布；

将所述丝素蛋白纳米纤维非织造布裁剪后平铺至Transwell小室底部，再将Transwell小室内添加第6代培养液；

将得到的第5代胎盘间充质干细胞培养物，用PBS洗涤多次，调整浓度至10⁷个/mL左右后接种至Transwell小室中，将Transwell小室置于添加有所述第6代培养液的Transwell板的小孔中；

将Transwell培养板置于37℃、5％CO₂、0.5％O₂培养条件下培养2～3天，可得到第6代胎盘间充质干细胞培养物。

7.权利要求3～6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述分离纯化以得到所述胞外囊泡的步骤具体包括：

收集所述第5或6代胎盘间充质干细胞培养物，300g离心10min，取上清液后，取上清液2000g离心20min，去除细胞碎片；

利用(Mr)100 000MWCO的超滤管进行超滤浓缩后，浓缩液100000g离心70min，小心弃去上清液，用PBS重悬；

重悬液再次用100000g离心70min；再次用PBS重悬，即可得到所述胞外囊泡的重悬液。

8.一种胞外囊泡制剂，包含权利要求1或2所述的胎盘间充质干细胞来源的胞外囊泡，以及用于稳定所述胞外囊泡且药学上可接受的辅料。

9.权利要求1或2所述的胞外囊泡、或权利要求3～7任一项所述的制备方法制得的胞外囊泡在制备抗卵巢早衰相关药物制剂中的应用。