[发明专利]一种拜耳威利格单加氧酶突变体及其应用

权利要求书

1.一种手性亚砜类化合物的制备方法，其特征在于，其包含以下步骤：在单加氧酶突变体的存在下，将化合物1进行单加氧反应，得到手性亚砜类化合物即可；

其中，*表示对应硫原子的手性为S构型或者R构型；

R₁为H、Me、MeO、F、Cl或I；

所述单加氧酶突变体为在如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列上具有选自以下一个或多个位点的氨基酸残基的差异：

第3位、第14位、第34位、第43位、第71位、第111位、第141位、第143位、第144位、第149位、第174位、第209位、第240位、第246位、第248位、第277位、第288位、第307位、第326位、第327位、第341位、第383位、第386位、第388位、第390位、第400位、第415位、第426位、第432位、第433位、第434位、第435位、第438位、第448位、第449位、第464位、第481位、第488位、第489位、第490位、第505位、第516位、第526位、第537位和第540位。

2.如权利要求1所述制备方法，其特征在于，其满足下述条件的一个或多个：

(1)所述单加氧反应的反应溶剂为缓冲液、或、缓冲液和有机溶剂的混合物；所述有机溶剂优选选自醚类溶剂、环氧类溶剂、酯类溶剂、亚砜类溶剂、酰胺类溶剂和醇类溶剂中的一种或多种；所述醚类溶剂可选自甲基叔丁基醚、异丙醚、四氢呋喃和2-甲基四氢呋喃中的一种或多种；所述环氧类溶剂可为1,4-二氧六环；所述酯类溶剂可为乙酸乙酯；所述亚砜类溶剂可为二甲基亚砜；所述酰胺类溶剂可为N,N-二甲基甲酰胺；所述醇类溶剂可选自甲醇、乙醇、异丙醇和正丁醇中的一种或多种；所述缓冲液可选自硼酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、三羟甲基甲胺盐缓冲液和三乙醇胺盐缓冲液中的一种或多种；

(2)当所述单加氧反应的反应溶剂为缓冲液和有机溶剂的混合物时，所述有机溶剂与所述缓冲液的体积比为(0.01-0.5):1；

(3)所述单加氧酶突变体与所述化合物1的质量比为(0.01～1):1；

(4)所述制备方法进一步包含氧化剂，所述氧化剂优选为含氧气体；

(5)所述制备方法进一步包含氢供体，所述氢供体优选为NADPH，或NADP⁺和异丙醇；

(6)所述制备方法中进一步包含氧化还原酶，所述氧化还原酶优选为KRED；

(7)所述制备方法进一步包含过氧化氢酶；

(8)所述单加氧反应的反应温度为25℃～50℃；

(9)所述单加氧反应的反应时间为16～24h；

(10)所述单加氧反应的pH值为6.0～10.5；

(11)所述手性亚砜类化合物的制备方法，其包括以下步骤：向所述反应溶剂中，加入所述化合物1和所述单加氧酶突变体，混合均匀后在25℃～50℃下反应即可；

(12)所述单加氧反应结束后，通过以下步骤进行后处理，其包含：萃取，浓缩；

(13)所述差异为缺失、增加或替换，优选为替换；和

(14)所述单加氧酶突变体为在如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第3位氨基酸残基替换为A、F、G、H、K、L、M、S、T或V，和/或，第14位氨基酸残基替换为A、C、D、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第34位氨基酸残基替换为C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、R、S、T、V、W或Y，和/或，第43位氨基酸残基替换为C、F、G、H、I、K、L、M、P、R、V、W或Y，和/或，第71位氨基酸残基替换为A、D、G、H、I、K、M、P、Q、R、S、T、V或Y，和/或，第111位氨基酸残基替换为C、E、F、G、I、K、M、N、P、R、S、T、V、W或Y，和/或，第141位氨基酸残基替换为A、D、E、G、H、I、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第143位氨基酸残基替换为A、C、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T或W，和/或，第144位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、V或W，和/或，第149位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V或W，和/或，第174位氨基酸残基替换为A、C、D、E、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、V、W或Y，和/或，第209位氨基酸残基替换为C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y，和/或，第240位氨基酸残基替换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、V或Y，和/或，第246位氨基酸残基替换为A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第248位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、R、S、T、V或Y，和/或，第277位氨基酸残基替换为A、C、D、E、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第288位氨基酸残基替换为C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第307位氨基酸残基替换为D、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第326位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第327位氨基酸残基替换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y，和/或，第341位氨基酸残基替换为A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第383位氨基酸残基替换为C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、S、T、W或Y，和/或，第386位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、H、I、K、M、P、R、S、T、V、W或Y，和/或，第388位氨基酸残基替换为A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y，和/或，第390位氨基酸残基替换为A、C、E、F、G、H、I、K、L、N、P、R、S、T、V、W或Y，和/或，第400位氨基酸残基替换为A、C、D、F、H、I、K、L、N、P、Q、S、T、V或W，和/或，第415位氨基酸残基替换为A、C、E、F、G、I、K、L、M、N、R、S、W或Y，和/或，第426位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、K、M、N、P、Q、R、S、T、V或W，和/或，第432位氨基酸残基替换为A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、S、V或Y，和/或，第433位氨基酸残基替换为C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、V或Y，和/或，第434位氨基酸残基替换为A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、V、W或Y，和/或，第435位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、I、K、N、Q、R、S、V、W或Y，和/或，第438位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、Q、R、T、V、W或Y，和/或，第448位氨基酸残基替换为F、H、K、L、R、S、V或Y，和/或，第449位氨基酸残基替换为C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、V、W或Y，和/或，第464位氨基酸残基替换为A、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、V或Y，和/或，第481位氨基酸残基替换为A、C、D、E、G、H、K、L、N、P、Q、R、S、T、V或W，和/或，第488位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、S、T、V、W或Y，和/或，第489位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W或Y，和/或，第490位氨基酸残基替换为A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y，和/或，第505位氨基酸残基替换为A、C、D、E、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第516位氨基酸残基替换为C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，和/或，第526位氨基酸残基替换为C、F、G、K、S、V或Y，和/或，第537位氨基酸残基替换为D、H、K、L、M、R、S、T或W，和/或，第540位氨基酸残基替换为D、K、L、M、N、Q、S或W。