[发明专利]一种基于发色底物法的蛋白C活性测定试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于发色底物法的蛋白C活性测定试剂盒，蛋白C为一种维生素K依赖的血浆丝氨酸蛋白酶酶原，包括R1试剂、R2试剂与稀释试剂；R1试剂包括蛋白C激活剂、第一缓冲液和第一辅料；R2试剂包括发色底物Pca‑5297、第二缓冲液和第二辅料；稀释试剂包括第三缓冲液和第三辅料，第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液的pH为7.2‑7.6；本发明将蛋白C激活剂和发色底物Pca‑5297搭配使用，检测时切割效率高，反应信号强，反应速度快，灵敏度高，线性范围宽，反应时间短，增加了样本的区分度，有利于线性范围建立以及临床样本测试；试剂为液态，使用方便、成本低廉、稳定性好。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于发色底物法的蛋白C活性测定试剂盒。

背景技术

蛋白C(简称PC)是一种维生素K依赖的血浆丝氨酸蛋白酶酶原，主要在肝脏中合成，它在凝血酶或凝血酶-血栓调节蛋白复合物的作用下被转变成活化蛋白C(简称APC)。APC与其辅因子蛋白S(简称PS)形成复合物，有灭活Va和VIIIa及增加纤溶的活性，因此具有抗凝作用。当PC缺乏时，因子Va和VIIIa灭活减少及血循环纤溶能力降低，因此促使纤维蛋白形成过多，而导致血栓形成，因此，对PC的测定，对于疾病的预防、监控和治疗有重要作用。

目前，对蛋白C进行定量检测的方法可分为三类：免疫法、APTT凝固法和发色底物法。其中，免疫学方法中的抗原-抗体反应虽然能准确检测PC抗原的含量，但它对特异性抗体的筛选需要高度纯化的PC，这一条件十分苛刻；其次是其整个检测过程时间较长，无法满足急诊病人和临床及时诊断的需要。而APTT凝固法用蛇毒激活PC后，加入到待测血浆中，其中PC的含量对应着其血浆凝固时间的延长的比例，该方法能够特异性检测蛋白C含量，但对结果的影响因素较多，检验人员的经验往往直接影响到检测结果的准确性和重复性。发色底物法早期采用凝血酶-凝血酶调节蛋白作为激活剂，但因为血浆中存在PC抑制剂和干扰物质，其不能直接检测血浆中的PC活性，而需要把PC从血浆中分离出来，这不仅会浪费大量人力物力，检测速度也较慢。

国内市售大部分的PC活性测定试剂盒(发色底物法)主要是进口试剂盒，其价格昂贵，采货周期较长，并且多为冻干粉形态，制作工艺繁琐，成本高且试剂的瓶间差也会因冻干被拉大，冻干粉试剂使用前均需要复溶，并且静置一段时间后才能使用，不利于客户的操作；该类PC活性测定试剂盒，盒内不附赠复溶剂，客户自行选用的复溶剂质量无法把控，对测试结果带来了一定的影响；试剂灵敏度差，线性范围窄，特异性差，导致其检测结果的重复性较差，并且抗干扰能力差，结果易受各种因素的影响，无法反应人体内真实的蛋白C活性水平。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的缺陷，提供一种基于发色底物法的蛋白C活性测定试剂盒，价格低廉、全液体、试剂灵敏度高、特异性高、线性范围宽。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于发色底物法的蛋白C活性测定试剂盒，所述蛋白C为一种维生素K依赖的血浆丝氨酸蛋白酶酶原，包括R1试剂、R2试剂与稀释试剂；

所述R1试剂包括蛋白C激活剂、第一缓冲液和第一辅料，所述第一缓冲液的pH为7.2-7.6；

所述R2试剂包括发色底物Pca-5297、第二缓冲液和第二辅料所述第二缓冲液的pH为7.2-7.6；

所述稀释试剂包括第三缓冲液和第三辅料，所述第三缓冲液的pH为7.2-7.6。

进一步地，优选所述蛋白C激活剂的浓度为0.1~0.5 IU/mL。

进一步地，优选所述蛋白C激活剂为蛇毒提取物。

进一步地，优选所述发色底物Pca-5297的浓度为0.5~2mg/ml。

进一步地，优选所述第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液分别为Tris缓冲液、MES缓冲液、MOPS缓冲液、柠檬酸缓冲液、PBS缓冲液中的至少一种。