[发明专利]一种通过光镊捕获膜纳米管内的转运颗粒实时测定马达蛋白力学参数的方法

说明书

本发明提供了一种通过光镊捕获膜纳米管内的转运颗粒实时测定马达蛋白力学参数的方法。本发明以量子点、染料和荧光蛋白作为荧光标记物，对膜纳米管内颗粒及微丝、微管和马达蛋白分别进行标记。通过单颗粒示踪技术，对膜纳米管内颗粒及相关马达蛋白转运过程进行实时成像，并使用光镊对正在转运的目标颗粒进行捕获并测定其力谱信息，实现对膜纳米管内驱动颗粒运动的马达蛋白的力学参数的实时测定。本方法不仅通过共聚焦快速荧光成像的方式对小于光学衍射极限的颗粒进行示踪，而且在示踪的基础上采用光镊准确捕获该颗粒物。本发明可广泛应用于生物领域，研究细胞间通过膜纳米管转运物质的力学机制和信息。

技术领域

本发明属于光镊操纵技术领域，也属于单颗粒示踪技术领域，其包含生物物理、分子生物学、纳米生物技术和光学成像等交叉技术领域。

背景技术

光镊最早于1986年被美国科学家Ashkin发明，它是由一束高斯光束经过透镜聚焦后产生的激光束，与光阱附近的粒子产生两种作用力。一种沿着光传播方向运动的力叫做散射力，另一种沿着光场梯度方向，将微粒推向光场梯度最强位置的力叫做梯度力。当梯度力远大于散射力时，微粒将被牢牢束缚在光阱中心附近。光镊相较于其他测力方式具有远距离、无接触、无损伤等优点。光镊力的模型根据其颗粒粒径大小分为几何光学模型、电磁模型与米氏模型，如果光镊捕获的粒子尺寸远远小于激光波长，则为瑞利粒子，适用的受力模型为电磁模型。在用无机发光材料如量子点对颗粒进行荧光标记时，可以在保证生物活性的同时增加折射率与极化率，从而增加对颗粒捕获的稳定性。

单颗粒示踪是一种通过荧光显微镜实时、原位研究活细胞内生物动态发生过程的强大工具。目前，单颗粒示踪技术已在细胞膜的结构功能，分子马达运输机制、病毒侵染宿主细胞机制等领域得到广泛应用。通过对单颗粒的时间和空间上的检测并通过软件进行分析，可以揭示病毒侵染的机制和条件。同时，还可以通过这种方式在膜纳米管内转运货物时，对其颗粒和马达蛋白进行动态示踪，从而深入了解驱动膜纳米管内货物转运的力学机制。

膜纳米管(MNTs)是一种长的膜状肌动蛋白延伸，将一个细胞连接到另一个细胞，以允许在两个连接的细胞之间交换细胞器和信号分子。可在哺乳动物细胞之间的长距离内保持膜连续性，代表了细胞间通讯的新生物学原理。膜纳米管不同于众所周知的丝状伪足，因为它们更长(长度可达几个细胞直径)，并且悬浮在细胞培养基中而不附着在基底上。最近的研究表明膜纳米管可转运病毒、量子点、细胞器等物质，而其中的货物在膜纳米管内转运主要由肌动蛋白(myosin)、驱动蛋白(kinesin)或动力蛋白(dynein)等马达蛋白驱动货物沿着微丝或微管运动。现有关于胞外马达蛋白的力学信息以及运动机制有了一定的研究，但在活细胞内某些马达蛋白的力学信息和细胞外有较大的差别，这是由于细胞内的细胞质、细胞核和多种细胞器都会对马达蛋白的转运造成很大的影响。

目前尚缺乏一种可实现细胞内实时准确测定马达蛋白力学参数，并可进一步获取马达蛋白力学机制的方法。

发明内容

针对现有的研究对于膜纳米管内物质的转运行为和膜纳米管内马达蛋白的工作机制还不清楚，有可能涉及几种不同的行进性线性分子马达参与其中的问题，本发明将单颗粒示踪技术和光镊技术相结合，研究膜纳米管内颗粒的转运过程的受力信息进而反映马达蛋白的力学机制。因此，本发明提供一种将光镊与共聚焦快速荧光成像相结合测定膜纳米管内颗粒转运过程中马达蛋白力学参数的方法，通过光镊捕获膜纳米管内的转运颗粒，可以实时准确测定马达蛋白的力学参数，并进一步获取马达蛋白的力学机制。

本发明提供的技术方案如下：

一种通过光镊捕获膜纳米管内的转运颗粒实时测定马达蛋白力学参数的方法，包括如下步骤：

(1)对宿主细胞的微丝、微管和马达蛋白进行荧光标记；

(2)选用通过量子点或荧光染料修饰的粒子作为转运颗粒；

(3)调节宿主细胞的密度控制细胞间膜纳米管的生成，显微镜明场下观察细胞间的膜纳米管的位置；