[发明专利]一种基于受体-抗体夹心的Cry毒素检测方法

说明书

本发明涉及一种基于受体‑抗体夹心的Cry毒素检测方法，包括：1)将棉铃虫钙黏蛋白毒素结合区片段稀释后包被过夜2)次日加入封闭液反应；3)加入待测样品反应；4)加入Cry2Aa、Cry1Ab兔多克隆抗体反应；5)加入HRP标记的羊抗兔抗体反应；6)加入显色液反应；7)加入终止液，测定OD₄₅₀值，带入标准线性方程即可获得Cry毒素的残留量；上述方法利用HaCad‑TBR作为捕获抗体，可同时检测Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Aa、Cry2Ab四种毒素，且灵敏度高，可用于农产品新鲜叶片和谷物中残留的Cry毒素蛋白残留量检测和类型分析研究。

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，特别是一种用于苏云金芽孢杆菌Cry毒素(包括Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Aa、Cry2Ab)检测的“受体-抗体”检测方法。

背景技术

1981年Yamamoto和McLaughlin首次从苏云金芽孢杆菌kurstaki亚种的伴孢晶体中分离得到分子量分别为130kDa(P1)和66k Da(P2)两个杀虫蛋白组分，其中P1蛋白(Cry1类毒素)对鳞翅目害虫具有毒性，而P2蛋白(Cry2类毒素)对鳞翅目和双翅目害虫均有毒性。近几十年来，全球转基因作物面积显着增加，自第一个转基因番茄以来，发展中国家和发达国家种植了1.8亿公顷。然而，由于转基因作物对环境和人类健康具有潜在风险，导致转基因作物并未被广泛接受。因此，有必要通过使用现场、快速和可靠的方法对食品材料进行识别、量化和信息收集来创建转基因商品的监督和监控。

双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)是Cry毒素检测分析的常用方法之一，通常基于兔多克隆抗体(PAbs)、单克隆抗体(mAbs)、单链可变片段(scFv)或驼源纳米抗体等进行检测。然而，传统单克隆抗体的制备需要一个复杂的程序，单链抗体或驼源纳米抗体通常在制备过程中也十分繁琐，且这些抗体的产量低、不稳定，检测成本高。同时由于抗体对Cry毒素具有特异性识别作用，传统的单克隆抗体或兔多克隆抗体建立的双抗夹心检测方法只能特异性检测某一种Cry毒素，不具有广谱性，不能同时检测多种Cry毒素(如Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Aa、Cry2Ab等)，对于存在多种毒素残留的农产品的检测费用高，且难覆盖多种Cry毒素的检测，进一步限制了对转基因作物种Cry毒素的检测。

Gao等人在研究Cry1A类和Cry2A类毒素的功能受体时，发现异源表达的棉铃虫钙黏蛋白(HaCad-TBR)毒素结合区片段与部分Cry毒素具有一定的结合能力，但该研究最终的结果显示棉铃虫钙黏蛋白受体并非是Cry1类和Cry2类的功能受体，未涉及任何检测性质的实验。

同时，目前研究报道中Cry毒素的潜在功能受体众多，如类钙黏蛋白(CAD)、氨肽酶N(APN)、碱性磷酸酯酶(ALP)以及ATP结合盒式转运蛋白(ABC)家族等靶潜在功能受体；且不同种类的Cry毒素在其功能受体上差异较大，同一种毒素对不同昆虫的作用受体也不相同，因此在确定昆虫受体片段上十分繁琐，相较于传统ELISA检测制备一个单克隆抗体，确定一个能够用于广谱性检测的昆虫受体更加困难。目前，利用HaCad-TBR技术检测多种Cry毒素的方法尚未见报道。

发明内容

针对上述问题，本申请以棉铃虫钙黏蛋白毒素结合区片段(HaCad-TBR)和两种兔多克隆抗体(Cry1Ab PAbs、Cry2Aa PAbs)为基础，提供一种全新的Cry毒素检测方法，能够一次性同时检测四种Cry毒素(Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Aa、Cry2Ab)，克服了传统的双抗夹心免疫检测方法一次只能单一检测某一种Cry毒素的问题。

具体而言，本申请是通过如下技术方案实现的：

首先，本申请提供了一种基于“受体-抗体”夹心的Cry毒素检测方法，所使用的检测试剂为棉铃虫钙黏蛋白(HaCad-TBR)毒素结合区片段和两种兔多克隆抗体(Cry1AbPAbs、Cry2Aa PAbs)，所述Cry毒素包括Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Aa和Cry2Ab。其具体检测方法如下：