[发明专利]一种哺乳动物乳中低聚糖的检测方法

说明书

本发明是一种哺乳动物乳中低聚糖的检测方法，该方法包括如下步骤：(1)将2‑5mL乳去除上层脂肪；(2)取(1)中下清液进一步去除脂肪；(3)取(2)中上清液，加入2‑4倍体积乙醇，混合均匀，去除蛋白质；(4)收集(3)中上清液，蒸发去除乙醇，将得到的混合溶液冻干；(5)将冻干固体溶于去离子水中，与NaBHsubgt;4/subgt;混合均匀，反应2h；(6)反应后的混合溶液用石墨化碳固相萃取小柱纯化，得到还原后的低聚糖固体；(7)将(6)中得到的低聚糖固体重新溶于超纯水中，上样HPLC‑QqQ‑MS进行分析。本发明采用HPLC‑QqQ‑MS联用，对不同哺乳动物乳中的低聚糖进行测定，简化了前处理以及分析过程，克服现有处理及分析过程步骤繁琐的缺陷。

技术领域

本发明涉及低聚糖检测的领域，特别涉及一种哺乳动物乳中低聚糖的检测方法。

背景技术

低聚糖是哺乳动物乳中重要的一类生物活性成分，具有维持肠道微生态平衡、调节机体免疫、抵御致病菌感染等功能。不同哺乳动物来源的低聚糖均显示出潜在的生物活性价值，可作为食品组分添加到医疗或功能性食品中。哺乳动物乳是自然界低聚糖的主要来源，因此对哺乳动物乳中的低聚糖进行检测，是大规模提取低聚糖进而开发新型医疗或功能性食品的必要前提。

目前对母乳中低聚糖的检测报道较多，测定方法主要有液质联用(Porfirio etal.,2020)、高效阴离子交换色谱(Landberg,Lundblad,1998)、高效液相色谱(McGuire et al.,2017)。其中液质联用使用不同离子源或分离技术与飞行时间质谱(TOF-MS)结合是目前检测到乳中低聚糖种类最多的一种检测技术，可定性检测多达200多种母乳中的低聚糖(Wu,Grimm,German,Lebrilla,2011；Wu,Tao,German,Grimm,Lebrilla,2010)。基质辅助激光解吸(MALDI)离子源与TOF-MS联用是目前最常用的母乳低聚糖测定法。

专利申请202011360676.3公开的一种乳中母乳低聚糖的检测方法，包括如下步骤：A)将乳样品采用沉淀剂沉淀蛋白，过滤，得到试样溶液；B)将试样溶液采用滤膜和净化柱净化处理，得到待测液；C)将待测液采用阴离子交换色谱进行测定，得到乳中母乳低聚糖的含量。

高效阴离子交换色谱和高效液相色谱法对低聚糖同分异构体检测效果较差，可测定的低聚糖范围较窄。TOF-MS尽管可检测到数量较多的低聚糖，但该技术的预处理通常需要采用不同前处理手段对乳中的中性和酸性低聚糖分别进行处理，分析过程中也需在不同的离子模式下对中性和酸性低聚糖分别进行检测，因此前处理及分析过程步骤繁琐。并且，TOF-MS无法对同分异构体进行区分(van Leeuwen,2019)，其对乳中低聚糖的检测还依赖于色谱分离技术，在同分异构体无法被完全分离的情况下不能进行准确定性及定量测定。同时，由于其他哺乳动物乳中低聚糖含量低于母乳中的含量，因此当下的报道中适用于检测母乳低聚糖的测定方法未必适用于检测其他哺乳动物乳中的低聚糖。目前未有涉及采用一种检测方法测定多种哺乳动物乳中低聚糖方法的报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明的首要目的是提供一种哺乳动物乳中低聚糖的检测方法，该方法采用HPLC-QqQ-MS联用，对不同哺乳动物乳中的低聚糖进行测定，简化了前处理以及分析过程，克服现有处理及分析过程步骤繁琐的缺陷。

本发明的另一个目的是提供一种哺乳动物乳中低聚糖的检测方法，本发明的检测方法结果准确、稳定、可靠。

申请人研究发现，三重四极杆质谱QqQ-MS应用多反应监测技术MRM对目标物质进行确定，低聚糖的同分异构体在无法被完全分离的情况下也可以被QqQ-MS测定，并且QqQ-MS对低聚糖的检测只需在一种离子模式下进行，相比TOF-MS简化了前处理以及分析过程。同时，QqQ-MS具有较高分辨率及灵敏度，检测下限可达到ppb浓度水平，可适用于不同哺乳动物乳中低聚糖含量测定。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：