[发明专利]一种哺乳动物乳中低聚糖的检测方法

权利要求书

1.一种哺乳动物乳中低聚糖的检测方法，其特征在于方法包括如下步骤：

1，将2-5mL乳在4℃下以4000-6000rpm的速度离心20-30min，去除上层脂肪；

2，取1中下清液加入4-5倍体积Folch溶液，混合均匀，在4℃下以4000-6000rpm的速度离心20-30min，进一步去除脂肪；

3，取2中上清液，加入2-4倍体积乙醇，混合均匀，于-80℃放置2-4h，在室温解冻后，于4℃下以4000-6000rpm的速度离心20-30min，去除蛋白质；

4，收集3中上清液，在35-40℃下旋转蒸发去除乙醇，将得到的混合溶液冻干；

5，将冻干固体溶于2-5mL去离子水中，取0.5-1mL水溶液与0.5-1mL 2MNaBH₄混合均匀，置于65℃反应2h；

6，反应后的混合溶液用石墨化碳固相萃取小柱纯化，在35-40℃下旋转蒸发去除乙醇，将得到的水溶液冻干，得到还原后的低聚糖固体；

7，将6中得到的低聚糖固体重新溶于0.5-1mL超纯水中，用0.05M NaCl溶液稀释至2-5mL，加入0.2-0.5mL 2ppm的棉子糖作为内标，过0.22m滤膜后上样HPLC-QqQ-MS进行分析，其中，HPLC-QqQ-MS的色谱柱为多孔石墨碳柱；

采用Hypercarb保护柱10×2.1mm,3m和Hypercarb色谱分离柱100×2.1mm,3m进行分离，柱温为40℃，使用流动相A与流动相B进行梯度洗脱，流动相A为含有0.1％v/v氨水的乙酸铵10mM溶液，流动相B为含有0.1％v/v氨水的乙腈，梯度洗脱为第0-3分钟，流动相A为99％，流动相B为1％，流速为0.10-0.15mL/min；第3-4分钟，流动相A为99-95％，流动相B为1-5％，流速为0.15mL/min；第4-20分钟，流动相A为95-83％，流动相B为5-17％，流速为0.15mL/min；第20-30分钟，流动相A为83-58％，流动相B为17-42％，流速为0.15mL/min；第30-35分钟，流动相A为58-10％，流动相B为42-90％，流速为0.15mL/min；第35-50分钟，流动相A为10％，流动相B为90％，流速为0.15mL/min；第50-51分钟，流动相A为10-99％，流动相B为90-1％，流速为0.15-0.10mL/min；第51-60分钟，流动相A为99％，流动相B为1％，流速为0.10mL/min。

2.根据权利要求1所述的哺乳动物乳中低聚糖的检测方法，其特征在于步骤6中，反应后的混合液纯化为采用石墨化碳固相萃取进行纯化，具体操作步骤为：

1，石墨化碳固相萃取小柱经6mL超纯水洗涤后，用6mL含0.05％v/vTFA的乙腈溶液80％，v/v活化小柱，再经6mL超纯水洗涤，去除有机溶剂；

2，将步骤5中反应后的混合溶液上样到1中活化并洗涤后的小柱中，用20mL超纯水洗涤去除盐分；

3，用6mL 20％v/v乙腈溶液洗脱，收集洗脱液；

4，用6mL含有0.05％v/vTFA的乙腈溶液20％，v/v洗脱，收集洗脱液。

3.根据权利要求1所述的哺乳动物乳中低聚糖的检测方法，其特征在于步骤7中，所述的HPLC-QqQ-MS分析为采用QqQ-MS作为检测器在正离子模式下进行检测分析，具体参数为：

2’-岩藻糖基乳糖2’FL，离子对为513.2→367.2、513.2→205.1，碰撞能量分别为30V、40V，裂解电压为190V；3-岩藻糖基乳糖3FL，离子对为513.2→367.2、513.2→205.1，碰撞能量分别为30V、40V，裂解电压为150V；二岩藻糖基乳糖DFL，离子对为659.2→513.2、659.2→367.2，碰撞能量分别为30V、50V，裂解电压为200V；3’-唾液酸乳糖3’SL，离子对为658.1→367.2、658.1→205.1，碰撞能量分别为25V、50V，裂解电压为150V；6’-唾液酸乳糖6’SL，离子对为658.1→367.2、658.1→205.1，碰撞能量分别为25V、50V，裂解电压为160V；乳糖-N-新四糖LNnT离子对为732.2→387.9、732.2→367.2，碰撞能量分别为50V、50V，裂解电压为200V；乳糖-N-新六糖LNnH离子对为1097.5→753.4、1097.5→406.2，碰撞能量分别为60V、90V，裂解电压为280V；乳糖-N-岩藻五糖ILNFP I离子对为878.4→367.2、878.4→732.2，碰撞能量分别为60V、50V，裂解电压为240V；乳糖-N-岩藻五糖IILNFP II离子对为878.4→367.2、878.4→732.2，碰撞能量分别为65V、50V，裂解电压为240V；乳糖-N-岩藻五糖IIILNFP III离子对为878.4→387.9、878.4→367.2，碰撞能量分别为65V、70V，裂解电压为250V；岩藻糖基-3’-O-唾液酸乳糖FSL，离子对为804.3→513.2、804.3→367.2，碰撞能量分别为30V、50V，裂解电压为200V；唾液酸乳糖-N-四糖aLSTa，离子对为1023.3→732.2、1023.3→406.2，碰撞能量分别为30V、50V，裂解电压为200V；唾液酸乳糖-N-四糖cLSTc，离子对为1023.3→732.2、1023.3→406.2，碰撞能量分别为35V、70V，裂解电压为210V；二唾液酸乳糖-N-四糖DSLNT，离子对为1314.5→732.2，碰撞能量分别为60V，裂解电压为250V。