[发明专利]一种解析大脑单级输出神经网络的腺相关病毒载体及其应用

说明书

本发明提供一种解析大脑单级输出神经网络的腺相关病毒载体及其应用，所述腺相关病毒载体中包含重组腺病毒核心质粒；重组腺病毒核心质粒中包含至少两个启动子，以及由不同启动子分别驱动的能够到达轴突末端的第一标记蛋白和能够达到细胞核的第二标记蛋白的编码基因。所述重组腺病毒核心质粒中还编码能够提高第一标记蛋白表达丰度的转录激活蛋白。本发明利用同一个重组AAV基因组中多个启动子驱动多个目的基因表达，更为精确的解析大脑单级输出神经网络。本发明解决了rAAV1顺向跨单级突触系统不严谨、H129逆向标记以及毒性较大的应用范围限制，避免了普通的rAAV9标记过路纤维的缺陷。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种解析大脑中枢特定核团单级输出网络的病毒载体及其应用。

背景技术

神经环路是大脑执行一切功能的物质基础，人脑中约有10¹¹个神经元通过约10¹⁵个突触彼此相互交织形成了立体的脑神经网络，因此，解析大脑的神经环路连接是理解脑工作机制的基础。工具病毒作为目前最高效、应用最广的神经网络示踪手段，其具有易改造、传播方向特定、可携带外源基因且持续稳定表达等诸多优势，是绘制大脑连接图谱的利器。随着分子生物学和基因靶向技术的革新，现有的神经环路标记工具库虽然被不断地扩容，但用于解析直接输出神经网络的工具病毒仍然短缺。

目前，高滴度的重组腺相关病毒1型(rAAV1)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因缺失的单纯疱疹病毒1型毒株H129(H129-ΔTK-tdT)是常用的顺向跨单级突触病毒。高滴度的rAAV1在顺向跨突触传递过程中，只有很少量的病毒粒子能够进入下游脑区的神经元，因此一个放大步骤是必要的，通常使用rAAV1-hSyn-Cre(1×10¹³VG/mL)。此外，高滴度的rAAV1-hSyn-Cre会逆向入侵上一级神经元的轴突末端，这使得利用rAAV1顺向跨单级突触系统解析大脑中枢特定核团单级输出网络不严谨。单纯疱疹病毒1型H129毒株存在轴突末端逆向吸收现象，而且病毒毒力较大，这使得使用H129-ΔTK-tdT标记的结果不够严谨，且下游脑区被标记的细胞容易病变，需要借助免疫组化染色来增加荧光强度。因此，开发低毒、严谨的解析大脑单级输出网络的病毒载体具有十分重要的意义。

发明内容

为了解决现有技术中的不足，本发明的目在于提供一种解析大脑单级输出神经网络的腺相关病毒载体，该病毒能够精准地解析大脑特定核团神经元的直接输出网络。本发明利用重组腺相关病毒具有安全性高、免疫原性低、宿主范围广而且能够介导基因在动物体内长期稳定表达等优势，以其作为研究神经网络的结构与功能的载体。本发明通过基因重组提供了一种腺相关病毒载体，其通过两组启动子同时实现了在神经元的轴突末端高丰度荧光蛋白的定位，以及细胞核的荧光蛋白定位，从而屏蔽掉神经元的“过路”纤维，实现了对大脑特定核团神经元直接输出网络的精准标记。该载体在神经科学领域尤其在非人灵长类神经输出网络的解析中具有巨大的应用价值和市场前景。

为实现以上目的，本发明一个方面提供了一种解析大脑单级输出神经网络的腺相关病毒载体，所述腺相关病毒载体中包含重组腺病毒核心质粒；

重组腺病毒核心质粒中包含至少两个启动子，以及由不同启动子分别驱动的能够到达轴突末端的第一标记蛋白和能够达到细胞核的第二标记蛋白的编码基因。

进一步地，所述重组腺病毒核心质粒中还编码能够提高第一标记蛋白表达丰度的转录激活蛋白。

进一步地，所述第一标记蛋白选自Synaptophysin与eGFP、BFP、CFP、GFP、YFP、RFP、iRFP、Cerulean、Venus、eGFP、eCFP、eYFP、eBFP、DsRed、dTomato、tdTomato、mCherry、mKate、mApple、mBanana、mCitrine、mOrange、mPlum、tagRFP、tagBFP、HRP任一种的融合蛋白，优选为Synaptophysin-eGFP融合蛋白。