[发明专利]一种增强CAR-T功能的合成纳米抗体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种增强CAR‑T功能的合成纳米抗体及其制备方法和应用，所述抗体包括OX40BC3‑1、OX40BC3‑4、OX40BC3‑6和OX40BC3‑7中的至少一种序列，所述纳米抗体能够特异性结合OX40抗原，且具有很高的亲和力和显著的抗肿瘤作用，并且还可以增强CAR‑T的功能。

技术领域：

本发明涉及一种抗体及其制备方法和应用，具体涉及一种可以增强嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)的功能的抗OX40合成纳米抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

免疫治疗目前被认为是癌症治疗的主要替代方法之一。特别是，免疫疗法通过抑制或激活一些免疫检查点，例如PD-1/PD-L1通路(程序性细胞死亡蛋白1/程序性细胞死亡1配体1，CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞抗原4)，LAG-3(淋巴细胞活化基因)、OX40、TIM-3(T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3)、KIR(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)和TIGIT(T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域)来逆转肿瘤的免疫逃逸。

OX40，又称CD134、TNFRSF4或ACT35，是一种在CD4+和CD8+T细胞以及中性粒细胞和NK细胞中表达的膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体/肿瘤坏死因子超家族成员，编码一种50kDd的Ⅰ型跨膜糖蛋白。胞外区有191个氨基酸，包含了三个完整的以及一个稍短的富含半胱氨酸结构域(CRDs)。OX40是T细胞表面的正性共刺激分子，不表达于静止的T细胞表面，而在T细胞活化24-72小时有较高的表达，与其配体OX40L(又称CD252或TNFSF4)结合传递共刺激信号。OX40/OX40L信号在T细胞的活化、增值以及抑制凋亡过程中发挥着非常重要的作用。有研究表明，OX40通过各种信号途径，如NF-κB途径，引起细胞因子的大量产生，并产生记忆和效应T细胞。在非小细胞肺癌、卵巢癌、进展期胃癌，晚期结直肠癌、黑色素瘤和胶质母细胞瘤中，肿瘤免疫浸润中OX40的高表达与良好的预后有关。OX40激动剂免疫治疗可提高胶质母细胞瘤小鼠的存活率，防止卵巢癌中的肿瘤生长，并增加CD8+细胞浸润结直肠癌的预后意义。与OX40对T效应细胞(Teff)的共刺激作用相反，OX40共刺激消除了组成性表达OX40的Foxp3+Treg细胞的抑制功能。在一些动物模型中，OX40衍生信号显著抑制活化T效应细胞诱导新的Foxp3+Treg细胞。因此，OX40可能是外周Foxp3+Treg细胞的一个强有力的负调节因子。

综上所述，OX40激活效应T细胞并抑制调节T细胞，正向调控刺激肿瘤免疫，基于这些特点，OX40受体被广泛认为是新型肿瘤免疫治疗最有希望的靶点之一。

除其配体OX40L外，目前已有多种激动剂抗体亦可介导OX40的激活，例如pogalizumab，一种人源化IgG1单克隆OX40抗体已在临床(NCT02410512)上与atezolizumab联合用于晚期实体瘤的治疗，初期结果显示出良好的依从性。此外，还有例如Medi0562，IBI101和BGB-A445等激动剂抗体也纷纷进入临床阶段用于各种肿瘤的治疗。

尽管CAR-T在治疗血液癌症方面取得了成功，但它并不那么容易消除实体瘤。实体瘤通常在高度免疫抑制的环境中发展并且难以靶向，原因之一是肿瘤为环境的免疫抑制，使得T细胞失活。

2017年，美国食品药品管理局(FDA)批准了涉及CAR-T的治疗方法：来自患者的T细胞经基因改造后识别癌细胞表面上的特定蛋白，然后将这些经过基因改造的T细胞灌注到相同的患者体内，它们会对癌细胞产生靶向性免疫反应。CAR-T细胞已经成功地用于治疗白血病和淋巴瘤等血癌，而且往往取得了显著的效果，然而，这些治疗方法对实体瘤的成功率很低。当CAR-T细胞进入实体瘤时，它们很快就会失去功能。这种称为“衰竭”的状态伴随着它们表面上的PD1等免疫抑制蛋白增加，并且无法产生如干扰素γ和肿瘤坏死因子，使得CAR-T失去对肿瘤杀伤的能力。找到一种防止CAR-T细胞衰竭的方法已经成为癌症研究的重要目标。