[发明专利]一种增强CAR-T功能的合成纳米抗体及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种增强CAR-T功能的合成纳米抗体，其特征在于，包括以下序列中的至少一种：SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

2.一种制备权利要求1所述的一种增强CAR-T功能的合成纳米抗体的方法，包括以下具体步骤：

(1)噬菌体展示合成纳米抗体库的筛选：

(1.1)将OX40-mFc蛋白包被于96孔免疫板上，4℃过夜；

(1.2)用脱脂牛奶室温封闭2小时后清洗；

(1.3)每个文库取约10¹³个噬菌体，加入至4个包被孔中，室温震荡孵育2小时；

(1.4)每孔加入100μL 100mM HCl，室温震荡洗脱5分钟后，吸出洗脱液至EP管中，并加入1/8体积的1.0M Tris-HCl进行中和；

(1.5)用洗脱的噬菌体侵染3mL处于对数生长期的大肠杆菌SS320，37℃，220rpm培养30分钟后取出200μL侵染产物保存，向剩余菌液加入M13KO7辅助噬菌体，终浓度至10¹⁰个/mL，继续培养1小时；

(1.6)将上述培养液转移接种至50mL 2YT培养基中,37℃，220rpm过夜培养；

(1.7)重复步骤(1.1)至步骤(1.6)进行第二轮和第三轮的筛选；

(2)阳性克隆的分离与鉴定:

(2.1)三轮筛选后将第二、三轮的侵染产物分别涂布到LB/Carb+平板上37℃过夜培养；

(2.2)次日挑菌至2YT/Carb+/辅助噬菌体中过夜培养；

(2.3)用ELISA方法鉴定单克隆培养上清中噬菌体与OX40-mFc的结合力强弱，挑选阳性克隆进行Sanger测序；

(3)VHH-Fc抗体表达和纯化：

用PCR方法将步骤(2)中得到的阳性克隆VHH基因从噬菌体上清中扩增出来，用克隆试剂盒融合至带有linker+hIgG1的细胞表达载体上，将构建好的质粒转染ExpiCHO细胞，进行分泌表达,收获的细胞上清用蛋白A柱子进行亲和纯化得到带有Fc端的VHH-Fc完整纳米抗体。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤(1.1)中，OX40-mFc蛋白的浓度为30ug/mL，溶剂为磷酸盐缓冲生理盐水。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，步骤(1.2)中，脱脂牛奶的质量浓度为2％，溶剂为磷酸盐缓冲生理盐水。

5.根据权利要求2或3所述的方法，其中，步骤(1.5)中，大肠杆菌SS320的OD600不超过1.0。

6.根据权利要求2或3所述的方法，其中，步骤(1.5)中，M13KO7辅助噬菌体的终浓度为10¹⁰个/mL。

7.根据权利要求2或3所述的方法，其中，步骤(3)中，linker序列为SEQ ID NO.5。

8.权利要求1所述的一种增强CAR-T功能的合成纳米抗体的应用方法，包括以下具体步骤：

a.OX40 VHH-Fc抗体与OX40稳转细胞株的特异性结合:

(1)表达OX40蛋白的稳定细胞株的构建；

(2)流式特异性结合试验检测抗体与L929细胞株稳定表达OX40蛋白的结合；

(3)流式特异性结合试验检测抗体与Jurkat细胞株稳定表达OX40蛋白的结合；

b.OX40 VHH-Fc抗体对NF-kB信号通路的有效激活:

(1)Jurkat/NF-kB-Luc-hOX40稳定细胞系的构建；

(2)L929-CD32b稳定细胞系的构建；

(3)NF-kB报告基因实验；

c通过表面等离子共振分析抗OX40抗体与hOX40的动力学亲和力常数；

d.抗人OX40抗体对OX40和OX40L蛋白结合的抑制作用；

(1)通过报告基因法检测抗人OX40抗体对OX40和OX40L蛋白结合的抑制作用；

(2)通过流式检测法检测抗人OX40抗体对OX40和OX40L蛋白结合的抑制作用。