[发明专利]一种降低新冠病毒受体ACE2表达量的表观遗传载体

说明书

本发明公开了一种可用于指示新冠病毒受体ACE2表达量的载体、细胞株及其制备方法与应用，通过表观遗传基因编辑载体CRISPRoff‑v2.1中的蓝色荧光蛋白TagBFP替换为绿色荧光蛋白EGFP的编码序列、导入抗生素筛选标记基因和荧光标记基因，同时加入能切割ACE2启动子基因组的sgRNA，获得表观遗传修饰载体，并最终得到能够降低ACE2表达量的细胞株。本发明构建的载体和细胞能特异性地降低新冠病毒受体ACE2的表达，为治疗新冠提供了另一种具有可能性的技术手段和临床思路。

技术领域

本发明属于基因工程和基因遗传修饰领域，具体涉及一种可用于降低新冠病毒受体ACE2 表达量的表观遗传修饰载体，本发明还包括相应的制备方法、应用、细胞株和试剂盒。

背景技术

2019年底，由一种冠状病毒新毒株(2019-nCoV，即2019新型冠状病毒)引起的疫情迅速蔓延到全国和全世界。截止到2020年8月中旬，新型冠状病毒感染的肺炎(Novelcoronavirus pneumonia，NCP)在世界范围内已造成接近2000万例感染，并造成接近80万例死亡，给全世界社会、经济、政治、生活都造成了严重影响。

有研究表明：冠状病毒是通过S蛋白与宿主的受体结合，从而感染宿主细胞。冠状病毒 S蛋白的多样性高、机制复杂，β属冠状病毒的S蛋白大小以及在细胞表面与其结合的受体都各不相同。2003年给我国造成重大损失的SARS病毒也属于冠状病毒类。经研究证实，SARS-Cov是通过细胞膜表面ACE2受体进入细胞。而我国病毒所石正丽研究团队通过实验证明2019-nCoV可以通过细胞膜表面ACE2受体进入细胞，这与SARS-CoV进入细胞的途径是一样的。这些都提示ACE2可能是新型冠状病毒的潜在治疗靶点。

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR-associated) 系统是原核生物所拥有的一种针对外源性遗传物质的免疫系统。CRISPR/Cas系统具有操作简单、成本低廉和作用高效的特点，是目前已经被广泛用于基础研究的基因编辑新技术。 CRISPR/Cas系统是进行基因编辑的强大工具，可以对大部分物种的基因组进行精确编辑。当将含有Cas9蛋白编码基因和sgRNA表达序列的质粒转染某个细胞时，sgRNA可以靶向目标序列，Cas9蛋白则会使相应的DNA双链发生断裂。

最新的研究表明：当对Cas9关键位点进行突变，形成的dcas9不会造成DNA双链的断裂，对于临床应用具有更高的价值。而当对Cas9系统加上转录抑制因子(如KRAB)，就能抑制转录的发生，降低靶基因的表达量。2021年，国际顶级杂志《cell》在线发表了JonathanS.Weissman的研究成果，展示了一个可以通过表观修饰调控基因表达的载体CRISPRoff-v2.1 (含有dCas9、KRAB和TagBFP)。

发明内容

本发明旨在提供一种新的技术手段，对于临床治疗抗新冠病毒提供一种新的途径。

本发明提出一种可用于降低新冠病毒受体ACE2表达量的表观遗传修饰载体，并且通过 CRISPR/Cas技术构建可用于降低新冠病毒受体ACE2表达量的基因工程细胞株。

一方面，本发明提供了一种降低新冠病毒受体ACE2表达量的表观遗传修饰载体，将表观遗传基因编辑载体CRISPRoff-v2.1中的蓝色荧光蛋白TagBFP替换为绿色荧光蛋白EGFP 的编码序列，并加上抗性基因；同时，该表观遗传修饰载体中含有能切割ACE2启动子基因组的sgRNA。

本发明中，表观遗传基因编辑载体即CRISPRoff-v2.1，也是通过修饰获得的表观遗传基因编辑载体，其中TagBFP是蓝色荧光蛋白，均可参见《cell》在线2021年发表了Jonathan S. Weissman的文章。