[发明专利]一种将菌毛黏附蛋白fimH应用于群体感应动态调控系统提高大肠杆菌固定化发酵的方法

权利要求书

1.一株大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，向大肠杆菌BL21中导入含esaI/R系统的pUC19-PJ23119-MCS质粒，并将其与黏附基因fimH相结合。

2.根据权利要求1所述大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述esaI/R系统所含基因为核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的转录调控因子：esaI、esaR；核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的启动子：P_esaS、P_esaR；核苷酸序列分别如SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6所示的报告基因：红色荧光蛋白mCherry、绿色荧光蛋白EGFP。

3.根据权利要求1所述大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述fimH的核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示。

4.权利要求1～3中任意一项所述大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板，扩增得到esaI、esaR基因；以通用生物合成基因P_esaS、P_esaR所在的PUC19质粒为模板扩增得到P_esaS、P_esaR基因；以质粒pET28a-mcherry为模板扩增得到mCherry基因；以质粒pET-28a-EGFP为模板扩增得到EGFP基因；

(2)以步骤(1)所得片段为模板，通过overlap PCR扩增得到esaI+esaR片段、P_esaS+fimH+mCherry片段、P_esaR+EGFP片段；

(3)将步骤(2)所得基因片段克隆到质粒pUC19-PJ23119-MCS的HindⅢ和SacⅠ两个酶切位点之间，得到重组质粒pUC19-PJ23119-MCS-esaI/R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

(4)将步骤(3)所得重组质粒转化到大肠杆菌T1感受态中，从大肠杆菌T1中进行重组质粒的提取、纯化、回收；

(5)将步骤(4)提取得到的重组质粒转化到大肠杆菌BL21的感受态中，即得到大肠杆菌基因工程菌。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤(1)中，扩增esaI、esaR基因的引物分别为核苷酸序列如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示的esaI-F、esaI-R、esaR-F、esaR-R。

6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤(1)中，扩增P_esaS、P_esaR基因的引物分别为核苷酸序列如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18所示的P_esaS-F、P_esaS-R、P_esaR-F、P_esaR-R。

7.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤(1)中，扩增mCherry、EGFP基因的引物分别为核苷酸序列如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22所示的mcherry-F、mcherry-R、EGFP-F、EGFP-R。

8.权利要求1～3中任意一项所述大大肠杆菌基因工程菌在产木聚糖酶中的应用。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，将其核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示的木聚糖酶基因替换到所述大大肠杆菌基因工程菌中EGFP基因的位置，再将该菌接种到发酵培养基中发酵产木聚糖酶。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述发酵培养基为葡萄糖30g/L，氯化钠0.8g/L，硫酸铵20-22g/L，无水磷酸二氢钾2g/L，七水合硫酸镁0.8g/L，五水合硫酸锰0.02g/L，七水合硫酸铁0.02g/L，维生素B1 0.002g/L，酵母粉1g/L，碳酸钙15-30g/L。