[发明专利]一种使用融合蛋白体外重组多亚基SCF E3连接酶的方法及应用

权利要求书

1.一种E3连接酶的制备方法，包括：将eSCR融合蛋白质与F-box蛋白质在反应体系中进行反应，得到E3连接酶；

所述eSCR融合蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第10-1062位的融合蛋白质；

A2)将SEQ ID No.2的第10-1062位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应体系还含有50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)、MgCl₂、DTT和/或ATP；

和/或，所述反应在22℃-37℃下进行；

和/或，所述反应的时间为1-2小时。

3.利用权利要求1或2所述方法得到的E3连接酶。

4.一种制备泛素链的方法，包括：将权利要求1中所述eSCR融合蛋白质、F-box蛋白质、泛素活化酶E1、泛素结合酶E2与泛素单体在反应体系中进行反应，得到泛素链。

5.一种制备具有泛素化修饰目的蛋白的方法，包括：将目的蛋白、权利要求1中所述eSCR融合蛋白质、F-box蛋白质、泛素活化酶E1、泛素结合酶E2与泛素单体在反应体系中进行反应，得到泛素化的目的蛋白。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述反应体系还含有50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)、MgCl₂、DTT和/或ATP；

和/或，所述反应在22℃-37℃下进行；

和/或，所述反应的时间为1-2小时。

7.成套试剂，含有权利要求1中所述eSCR融合蛋白质与F-box蛋白质。

8.根据权利要求7所述的成套试剂，其特征在于：所述成套试剂还含有50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)、MgCl₂、DTT、ATP、泛素活化酶E1、泛素结合酶E2和/或泛素单体。

9.权利要求1中所述eSCR融合蛋白质或与权利要求1中所述eSCR融合蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B5)中的任一种：

B1)编码权利要求1中所述eSCR融合蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的细胞系、或含有B2)所述表达盒的细胞系、或含有B3)所述重组载体的细胞系。

10.下述任一应用：

X1)权利要求3所述的E3连接酶在制备泛素链或泛素化目的蛋白中的应用；

X2)权利要求3所述的E3连接酶在生产用于制备泛素链或泛素化目的蛋白的产品中的应用；

X3)权利要求7或8所述成套试剂在制备E3连接酶中的应用；

X4)权利要求7或8所述成套试剂在生产用于制备E3连接酶的产品中的应用；

X5)权利要求7或8所述成套试剂在制备泛素链或泛素化目的蛋白中的应用；

X6)权利要求7或8所述成套试剂在生产用于制备泛素链或泛素化目的蛋白的产品中的应用；

X7)权利要求9所述eSCR融合蛋白质或生物材料在制备E3连接酶中的应用；

X8)权利要求9所述eSCR融合蛋白质或生物材料在生产用于制备E3连接酶的产品中的应用；

X9)权利要求9所述eSCR融合蛋白质或生物材料在制备泛素链或泛素化目的蛋白中的应用；

X10)权利要求9所述eSCR融合蛋白质或生物材料在生产用于制备泛素链或泛素化目的蛋白的产品中的应用。