[发明专利]一种磁分离富集蜡样芽胞杆菌的方法

说明书

本发明公开了一种磁分离富集蜡样芽胞杆菌的方法，属于生物技术领域。本发明方法包括磁性纳米粒子与链霉亲和素的偶联，羧酸‑聚乙二醇‑生物素与头孢吡肟的偶联，头孢吡肟‑羧酸‑聚乙二醇‑生物素与样品液中的蜡样芽孢杆菌共孵育并结合在菌体表面，链霉亲和素修饰的磁性纳米粒子与样品液中的蜡样芽胞杆菌～头孢吡肟‑羧酸‑聚乙二醇‑生物素结合，在外加磁场的作用下，将捕获的蜡样芽孢杆菌与样品液进行分离及重悬等步骤。通过磁分离捕获到的蜡样芽孢杆菌可以直接进行后续分析；与传统的细菌磁分离方法相比，该方法不仅提高了样品中蜡样芽孢杆菌分离效率，同时也降低了成本。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种磁分离富集蜡样芽胞杆菌的方法。

背景技术

蜡样芽孢杆菌是一种产芽孢的革兰氏阳性菌，广泛分布于土壤、水、尘埃、淀粉制品、乳和乳制品等食品中，它的致病因子包括施普善和磷脂酶C，是常见的食品污染菌和条件致病菌。食品在20℃以上的条件下放置时，蜡样芽孢杆菌能迅速繁殖并产生毒素。由其引起的食物中毒可分为两种类型：①呕吐型：由耐热的肠毒素引起，于进食后出现恶心、呕吐症状、严重者偶可出现爆发性肝衰竭；②腹泻型：由不耐热肠毒素引起，进食后发生胃肠炎症状，主要为腹痛、腹泻和里急后重，偶有呕吐和发热。蜡样芽孢杆菌的筛查方法通常是传统培养法，需要经过预增菌、选择性增菌、生化筛选和血清学鉴定等步骤，整个过程耗时且费力，需经过5-7天才能获得结果。

因此，开发食品中蜡样芽胞杆菌的快速筛查方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种磁分离富集蜡样芽胞杆菌的方法，该方法可以在低梯度磁场下从复杂基质中快速分离目的菌蜡样芽胞杆菌，捕获效率高、操作简便、分离时间短，是一种高效、快速的蜡样芽胞杆菌检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种磁分离富集蜡样芽胞杆菌的方法，包括以下步骤：

(1)活化磁性纳米粒子与链霉亲和素进行偶联，得链霉亲和素-磁性纳米粒子复合物溶液，记为溶液A；

(2)盐酸头孢吡肟与羧酸-聚乙二醇-生物素进行偶联，得头孢吡肟-羧酸-聚乙二醇-生物素复合物溶液，记为溶液B；

(3)将待测样品溶液加入溶液B中，共孵育，得蜡样芽孢杆菌-头孢吡肟-羧酸-聚乙二醇-生物素复合物溶液，记为溶液C；

(4)将溶液A加入溶液C中，共孵育，得蜡样芽胞杆菌～头孢吡肟-羧酸-聚乙二醇-生物素～链霉亲和素-磁性纳米粒子复合物溶液，记为溶液D；溶液D在外加磁场的作用下，将蜡样芽孢杆菌与样品溶液实现分离，得蜡样芽胞杆菌～头孢吡肟-羧酸-聚乙二醇-生物素～链霉亲和素-磁性纳米粒子复合物。

发明机理：本发明采用的盐酸头孢吡肟通过氨基与羧酸-聚乙二醇-生物素的羧基相连，然后通过盐酸头孢吡肟中β-内酰胺环的羧基与细菌表面青霉素结合蛋白中的丝氨酸羟基共价结合形成丝氨酸脂以结合在蜡样芽胞杆菌表面，随后加入链霉亲和素修饰的磁性纳米粒子与蜡样芽胞杆菌～头孢吡肟-羧酸-聚乙二醇-生物素结合，形成蜡样芽胞杆菌～头孢吡肟-羧酸-聚乙二醇-生物素～链霉亲和素-磁性纳米粒子复合物，从而达到本发明富集分离的目的。

进一步地，步骤(1)所述活化磁性纳米粒子的表面修饰有羧基，其粒径为180nm；所述链霉亲和素的分子量为58KD；所述活化磁性纳米粒子与链霉亲和素的质量比为25∶2。

步骤(1)所述偶联的方法为：将链霉亲和素加入活化磁性纳米粒子溶液中，置于混匀仪上20～25℃反应2h，加入终浓度为10mg/mL的牛血清蛋白溶液，20～25℃持续孵育45min以封闭磁珠表面未结合链霉亲和素的羧基位点，孵育完成后用PBS溶液洗涤三次，重悬于PBS溶液中，得链霉亲和素-磁性纳米粒子复合物溶液。

进一步地，步骤(1)所述活化磁性纳米粒子的制备方法为：