[发明专利]一种磁分离富集蜡样芽胞杆菌的方法

权利要求书

1.一种磁分离富集蜡样芽胞杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)活化磁性纳米粒子与链霉亲和素进行偶联，得链霉亲和素-磁性纳米粒子复合物溶液，记为溶液A；

(2)盐酸头孢吡肟与羧酸-聚乙二醇-生物素进行偶联，得头孢吡肟-羧酸-聚乙二醇-生物素复合物溶液，记为溶液B；

(3)将待测样品溶液加入溶液B中，共孵育，得蜡样芽孢杆菌-头孢吡肟-羧酸-聚乙二醇-生物素复合物溶液，记为溶液C；

(4)将溶液A加入溶液C中，共孵育，得蜡样芽胞杆菌～头孢吡肟-羧酸-聚乙二醇-生物素～链霉亲和素-磁性纳米粒子复合物溶液，记为溶液D；溶液D在外加磁场的作用下，将蜡样芽孢杆菌与样品溶液实现分离，得蜡样芽胞杆菌～头孢吡肟-羧酸-聚乙二醇-生物素～链霉亲和素-磁性纳米粒子复合物。

2.根据权利要求1所述的磁分离富集蜡样芽胞杆菌的方法，其特征在于，步骤(1)所述活化磁性纳米粒子的表面修饰有羧基，其粒径为180nm；所述链霉亲和素的分子量为58KD；所述活化磁性纳米粒子与链霉亲和素的质量比为25∶2；

步骤(1)所述偶联的方法为：将链霉亲和素加入活化磁性纳米粒子溶液中，置于混匀仪上20～25℃反应2h，加入终浓度为10mg/mL的牛血清蛋白溶液，20～25℃孵育45min，孵育完成后用PBS溶液洗涤三次，重悬于PBS溶液中，得链霉亲和素-磁性纳米粒子复合物溶液。

3.根据权利要求1所述的磁分离富集蜡样芽胞杆菌的方法，其特征在于，步骤(1)所述活化磁性纳米粒子的制备方法为：

将磁性纳米粒子用PBS溶液洗涤后重悬于新的PBS溶液中，得磁性纳米粒子溶液；

将EDC和NHSS分别溶解于PBS溶液中，得EDC溶液和NHSS溶液，然后将EDC溶液和NHSS溶液加入磁性纳米粒子溶液中，20～25℃下活化1h，再依次用PBS溶液洗涤并重悬；所述磁性纳米粒子、EDC、NHSS的质量比为1000∶290∶325。

4.根据权利要求1所述的磁分离富集蜡样芽胞杆菌的方法，其特征在于，步骤(2)所述盐酸头孢吡肟的分子量为553.48，所述羧酸-聚乙二醇-生物素的分子量2000Da；

步骤(2)所述偶联的方法为：将羧酸-聚乙二醇-生物素溶解于PBS溶液中，得10mg/mL的羧酸-聚乙二醇-生物素溶液；

将EDC和NHSS分别溶解于PBS溶液中，得EDC溶液和NHSS溶液，然后将EDC溶液和NHSS溶液加入羧酸-聚乙二醇-生物素溶液中，置于混匀仪上20～25℃活化20min；加入盐酸头孢吡肟，20～25℃偶联4h；

且，所述羧酸-聚乙二醇-生物素与所述盐酸头孢吡肟的摩尔比为1∶1。

5.根据权利要求3或4所述的磁分离富集蜡样芽胞杆菌的方法，其特征在于，步骤(1)或步骤(2)所述EDC和NHSS的质量比为2.90∶3.25。

6.根据权利要求1所述的磁分离富集蜡样芽胞杆菌的方法，其特征在于，步骤(3)所述共孵育的条件为180rpm下37℃孵育25min。

7.根据权利要求1所述的磁分离富集蜡样芽胞杆菌的方法，其特征在于，步骤(4)所述共孵育的条件为180rpm下37℃孵育30min。

8.根据权利要求1所述的磁分离富集蜡样芽胞杆菌的方法，其特征在于，步骤(4)所述外加磁场的磁场强度为0.4T；具体操作为：溶液D置于离心管中在磁力架分离3min，用PBS溶液洗涤并重悬，得蜡样芽胞杆菌～头孢吡肟-羧酸-聚乙二醇-生物素～链霉亲和素-磁性纳米粒子复合物。

9.根据权利要求2-4和权利要求8任一所述的磁分离富集蜡样芽胞杆菌的方法，其特征在于，所述PBS溶液为无菌PBS溶液，浓度为0.01M，pH值7.4。

10.权利要求1-9任一所述方法在检测食品样品中蜡样芽孢杆菌定性或定量分析中的应用。