[发明专利]一种泥鳅抗菌肽Ma-sHep及其应用

说明书

本发公开了一种泥鳅抗菌肽Ma‑sHep及其应用。本发明提供抗菌肽Ma‑Hep与Ma‑sHep的基因序列和氨基酸序列，构建重组表达载体Ma‑shep‑pPIC3.5K、Ma‑shep‑pPIC9K和Ma‑hep‑pPIC9K，电击转化毕赤酵母KM71，通过甲醇诱导表达获得重组蛋白。本发明提供的抗菌肽Ma‑Hep与Ma‑sHep对多种革兰氏阴性菌和阳性菌都具有显著的抑菌活性，Ma‑sHep的抑菌活性更强且具有良好的热稳定性与酸碱耐受性。将胞内表达抗菌肽Ma‑sHep的酵母添加至饲料中，能够增强泥鳅对病原体的免疫。本发明为鱼类来源的抗菌肽的饲料开发和生产提供了理论支持与技术途径。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种泥鳅抗菌肽的真核表达，抗菌活性检测及饲料添加的应用探索。

背景技术

鱼类是水生低等脊椎动物，兼具先天性与适应性免疫系统。大多数的鱼类从胚胎时期就生活在水生环境中，适应性免疫系统不够完善，主要依靠先天免疫抵抗各种病害。随着水生环境的污染加重，出现了越来越多的鱼类疾病，包括细菌性疾病、真菌性疾病、寄生虫性疾病等。过去往往优先使用抗生素进行预防和治疗，但抗生素的滥用容易引起细菌抗药性。而抗菌肽具有广谱的抑菌活性，同时不易产生耐药性，对人体和环境副作用小，因此选择抗菌肽作为抗生素的新一代替代品。

抗菌肽广泛分布于自然界，并参与每个物种的先天宿主防御。当机体被病原体侵入时，抗菌肽充当了抵御侵入的第一屏障。鱼类hepcidins首先是在杂交条纹鲈鱼中被鉴定分离出来，含有8个保守的半胱氨酸残基，能够形成4个二硫键，平均等电点通常高于8，是典型的阳离子抗菌肽。鱼类hepcidin通常可以通过暴露在革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌被刺激诱导，此外，肿瘤细胞系如L-1210，真菌如酿酒酵母同样可以诱导hepcidins的表达。已经证实，hepcidins对多种革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌以及病毒都具有有效的抑制活性。同时，hepcidins还显示出调节多种免疫相关基因表达的能力。这充分表明了在鱼类中，hepcidins发挥先天免疫功能，充当抵御病原体入侵的第一道屏障。

毕赤酵母表达系统是目前研究比较清楚、应用最广的真核表达系统。使用毕赤酵母已经成功表达了数千种蛋白质，包括胰岛素、人血清白蛋白等。作为真核生物，毕赤酵母具有真核表达系统的许多优点，操作简单、价格低廉，并且能够对蛋白质进行翻译后修饰，修饰后的蛋白既可以在毕赤酵母细胞内发挥功能，也可以分泌出细胞至外环境。除了作为蛋白表达的宿主，酵母作为益生菌在水产养殖中也具有广泛的应用。酵母自身含有多种免疫刺激化合物，包括核酸、β-葡聚糖和几丁质以及甘露寡糖，同时还富含维生素、粗蛋白和肽，这些物质能够调节免疫反应并促使营养物质的消化与吸收，进而提升机体的抗菌能力与生长性能。目前还没有泥鳅抗菌肽被克隆并应用到饲料制备方面的报道。

发明内容

本发明的目的是提供泥鳅抗菌肽hepcidin全长与活化肽的基因序列。

本发明的再一目的是提供泥鳅抗菌肽hepcidin全长与活化肽的氨基酸序列。

本发明的再一目的是提供泥鳅抗菌肽hepcidin全长与活化肽的制备方法。

本发明的再一目的是提供一种含抗菌肽饲料的制备方法。

本发明的再一目的是提供抗菌肽饲料添加的应用。

本发明人通过基因克隆得到一个具有抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌活性的抗菌肽，且该抗菌肽对温度和酸碱度十分稳定，适合于饲料的添加。

上述泥鳅抗菌肽hepciidn全长命名为Ma-Hep，活化肽命名为Ma-sHep。

所述泥鳅抗菌肽Ma-Hep，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。

所述泥鳅抗菌肽Ma-Hep基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。