[发明专利]一种培养液及分离和体外培养小鼠附睾上皮细胞的方法

说明书

本发明涉及一种培养液及分离和体外培养小鼠附睾上皮细胞的方法，方法步骤包括：获取成年小鼠附睾组织的不同区段，通过胰蛋白酶和胶原蛋白酶I消化获取细胞团，RPMI 1640细胞培养液重悬，接种于孔板中，并置于34℃的二氧化碳培养箱。培养1天后细胞开始贴壁，并且呈团状分布，3天后细胞汇集长满。免疫荧光染色方法鉴定上皮细胞标记蛋白E‑cadherin和主细胞的标记蛋白AQP‑9。传代0次以及传代1次的上皮细胞活率分别能够达到80％和95％以上，表明该培养体系能够维持并恢复细胞活率。本发明通过酶消化法可高效分离小鼠附睾不同区段上皮细胞，并进行体外培养，为研究上皮细胞的分子功能提供合适的细胞模型。

技术领域

本发明涉及分离和培养附睾上皮细胞技术领域，具体涉及一种培养液及分离和体外培养小鼠附睾上皮细胞的方法。

背景技术

附睾(Epididymal)是男性生殖系统重要的器官之一，也是精子储存的主要场所。附睾管折叠成一个高度组织化的结构，由许多离散的、区域内的节组成，这些节在结构上由结缔组织隔开。哺乳动物的附睾按照解剖学可以分为四个区段，分别是起始端(Initialsegment)、头(Caput)、体(Corpus)和尾(Cauda)，与哺乳动物不同的是，人附睾通常包括后三部分[1]。每个区段被认为是一个独立的“器官”，创建其独特的腔内微环境，称为“区段特异性微环境”，不同的上皮细胞类型拥有各自的重叠基因、调节蛋白和信号转导[2]。附睾的这种区段式的特殊结构，与其不同区段的功能密不可分，它不但是精子储存的场所，也是精子成熟的主要器官，能够为精子成熟所需的微环境提供必要的基础条件。研究表明附睾能分泌附睾小体，它包含了蛋白质，小分子RNA以及脂滴，这些物质被转运分配到附睾管腔液，与精子结合参与精子成熟调节[3,4]。附睾不同区段分泌的蛋白质存在浓度上的差异，这与各个区段液体水分的含量变化密切相关。睾丸来源的部分水在附睾进行重吸收，这依赖于那些被称为水通道蛋白的小疏水蛋白分子，它们通过Na⁺、Cl^-、HCO₃^-的跨膜运动促进水转运进细胞膜，导致附睾管腔液离子组成的改变[1,5]。

附睾上皮细胞是组成附睾的主要细胞成分，按照形态和功能可将附睾上皮分为主细胞、基底细胞、透亮细胞、晕细胞以及狭窄细胞。其中主细胞成分最多，占所有细胞组分的80％以上，其次是基底细胞，附睾不同区段分布的上皮主细胞呈现不同的功能[1,6]。在附睾起始端，主细胞通过一些转运小体和酶类进行重碳酸盐的重吸收[7]。主细胞表达特异性蛋白水通道蛋白AQP-9，基底细胞表达特异性蛋白CK5以及CLDN1[8,9]。在附睾成熟的过程中，附睾管腔酸性微环境对精子的成熟至关重要，而附睾上皮细胞可以通过多种酸碱转运体调节水分、离子的重吸收和质子的分泌，参与维持附睾管腔酸性微环境平衡。上皮细胞的功能主要是分泌以及维持附睾管腔的微环境，其可以分泌上百种蛋白质，这些蛋白质会被转运到管腔液，参与附睾微环境的形成，支持精子成熟和运动。

小鼠附睾功能研究的细胞模型主要有PC1、DC1、DC2、DC3和mECap18[8,10]，然而以上细胞系主要来自附睾头部远端或近端，不适合作为附睾体和附睾尾的研究模型。尽管研究表明小鼠分离附睾上皮细胞，然而并没有构建系统的分离和培养体系[9]，构建合适的附睾上皮细胞分离培养体系成为当下男性生殖领域重要的研究方向之一。原代培养的附睾上皮细胞可为精子成熟和男性不育疾病研究提供合适的细胞模型。附睾上皮细胞体外培养体系的建立，可为深入研究附睾上皮细胞的功能奠定基础。

参考文献：

1.Elbashir,S.,et al.,Epididymal contribution to male infertility:Anoverlooked problem.Andrologia,2021.53(1):p.e13721.

2.Cornwall,G.A.,New insights into epididymal biology and function.HumReprod Update,2009.15(2):p.213-27.