[发明专利]利用水角叶片为外植体的胚性愈伤组织诱导及植株再生和快繁的方法

说明书

本发明属于植物细胞工程领域，涉及利用水角叶片为外植体的胚性愈伤组织诱导及植株再生和快繁的方法。以水角(Hydrocera triflora(L.)Wight.et Arn)幼嫩叶片为外植体，通过诱导胚性愈伤组织途径建立水角植株再生和快繁体系。包括：外植体的选取与消毒、胚性愈伤组织诱导、不定芽诱导、不定芽增殖和再生植株生根。通过综合比较不同激素种类及组合等对胚性愈伤组织诱导率、不定芽诱导率及增殖系数和生长状态的影响，优选到水角诱导胚性愈伤组织、植株再生和快繁的系列培养基。本发明为遗传转化改良水角性状提供了基础，提高了水角不定芽的增殖效率，可用于水角组培苗的工厂化生产。

技术领域

本发明涉及植物细胞工程技术领域，具体涉及利用水角叶片为外植体的胚性愈伤组织诱导及植株再生和快繁的方法。

背景技术

水角(Hydrocera triflora(L.)Wight.et Arn)属于凤仙花科水角属的单种属多年生水生草本植物，主要生长在沼泽地、湖边、水稻田中。水角花期长，在海南条件下，一年中有10个月在开花，其花色鲜丽，具有较高的观赏价值。水角属于濒危的国家二级保存水生植物，在国内仅分布于海南省的极少数区域中。由于水角耐旱性极差，其原生态环境常受到人为或气候影响，导致其种群数量极其稀少。申请人所在的研究团队期望利用植物细胞工程和转基因工程技术来培育出耐旱的水角新品种。

现有技术中，水角的离体培养技术是以水角的种子和茎段诱导出不定芽，对不定芽进行增殖培养，再进行生根培养。王景飞等(2019)以水角的茎段和种子为外植体，经常规消毒后，接种于芽诱导培养基中获得不定芽，在优化的增殖培养基培养30天后，获得不定芽的最大增殖系数为6.8(王景飞等，濒危水生植物水角的离体培养技术；江苏农业科学，2019，47(3):110-113)。上述技术尚未能通过愈伤组织的途径来建立水角再生体系，因而很难通过遗传转化技术来达到改良水角耐旱性状的目的。

发明内容

本发明的目的提供利用水角叶片为外植体的胚性愈伤组织诱导及植株再生和快繁的方法，为利用遗传转化技术来改良水角耐旱性状提供基础。同时，该方法的不定芽增殖系数比现有报道的增加近1倍，且不定芽增殖的培养时间比现有报道缩短一半，对促进水角组培苗工厂化生产提供了技术支撑。

本发明的技术方案如下所述：

一种利用水角叶片为外植体的胚性愈伤组织诱导及植株再生和快繁的方法，包括以下步骤：

(1)外植体的选取与消毒

于连续2个晴朗的天气取野外水角的幼嫩叶片，自来水冲洗30分钟，滤纸吸干，再用70％酒精消毒20秒，市售5％的蓝月亮牌漂白水(有效氯≥40g/L)消毒5分钟，无菌水冲洗5遍，无菌滤纸吸干。

(2)胚性愈伤组织的诱导

将消毒好的叶片切成0.5厘米×0.5厘米方块，接种至胚性愈伤组织诱导培养中，黑暗条件下培养30天后，培养温度为25℃±2℃，从水角叶片中诱导出胚性愈伤组织。

(3)不定芽的诱导

将步骤(2)获得的胚性愈伤组织接到至不定芽诱导培养基中，光照条件下培养30天后，胚性愈伤组织分化出不定芽；培养温度为25℃±2℃；光照强度为2000lx；光周期为16h/8h黑暗。

(4)不定芽的增殖培养

将步骤(3)不定芽连同愈伤组织块一起转移至新的不定芽诱导培养基中，光照条件下培养15天，形成丛生芽；将水角丛生芽切割成含3-5个不定芽的小块，接种至不定芽增殖培养基中光照条件下培养15天后，得到增殖的不定芽；培养温度为25℃±2℃；光照强度为2000lx，光周期为16h光照/8h黑暗。

(5)不定芽的生根培养